固氮菌分離及其莢膜染色綜合性實驗

樊 佳， 林文和， 郭子瑋， 董文捷， 李蕊晗， 耿 含， 汪 紅

(四川大學 生物科學實驗教學中心， 四川 成都 610065)

固氮菌在自然界廣泛分布于土壤和水中，可以固定轉(zhuǎn)化空氣中的氮氣，是生物固氮的重要微生物資源，在自然界中的氮素循環(huán)起重要作用，可有效提高土壤的氮素，對增加糧食產(chǎn)量，具有巨大的現(xiàn)實意義[1-5]。固氮菌形態(tài)特征明顯，經(jīng)分離培養(yǎng)后，成對的菌體呈“∞”排列，在它的細胞壁外面有一層黏液狀的物質(zhì)——莢膜，在染色后可清晰分辨[6]。固氮菌在自然界中分布廣泛，容易獲取，染色后形態(tài)特征明顯，是微生物教學中使用的常用菌種。

微生物學是一門實驗性和應用性很強的學科，隨著分子生物學、遺傳學等學科的迅速發(fā)展，微生物的研究方法已成為生物學科研究的基本技術和手段[7-9]。因此，開設從土壤分離固氮菌和莢膜染色實驗很有必要，可以鍛煉學生對微生物實驗的操作技能，培養(yǎng)學習興趣。目前，在微生物教材中，未介紹固氮菌的分離方法，且固氮菌不易保藏，需實驗教師臨用前分離，學生無法知道實驗菌的來源。為此，開設固氮菌分離及其莢膜染色綜合實驗，讓學生自己分離菌株后，再進行染色和觀察固氮菌的形態(tài)特征。目前教科書上的染色方法不易于學生掌握，成功率低，因此在莢膜染色方法上進行了改良，改良后成功率大大提高，學生易操作和觀察。通過開設微生物綜合性實驗，不僅能提升學生的實驗操作能力，還能考察學生對微生物所學知識的運用能力，激發(fā)學生的創(chuàng)新思維，并在微生物教學上獲得學生的普遍好評。

1 儀器及器材

儀器:生化培養(yǎng)箱LRH-250A型，電子天平BS224S型，高壓滅菌鍋LDZX-30KBS型，超凈工作臺SW-CJ-1F型，冰箱BCD-301型。

器材:玻璃試管，培養(yǎng)皿，移液槍(5 mL，1 000 μL、200 μL、10 μL)、酒精燈、錐形瓶、三角推棒、接種環(huán)、1.5 mL EP管。

2 實驗材料及試劑

實驗材料：新鮮土壤。

無氮培養(yǎng)基:甘露醇(葡萄糖)10 g，KH2PO40.2 g，CaSO40.2 g，NaCl 0.2 g，CaCO30.2 g，MgSO40.2 g，瓊脂20 g，1 000 mL蒸餾水，pH7.2，121 ℃高壓滅菌20 min。

實驗試劑：齊氏石炭酸復紅染液:混合A液及B液即成。A液:堿性復紅 0.3g，95%乙醇 10 mL；B液:石炭酸 5 g，蒸餾水95 mL。

黑色碳素墨水溶液:黑色碳素墨水與蒸餾水體積比為3∶1。

3 實驗方法

3.1 樣品采集

鏟取地表約2～3 cm土層，采集新鮮土壤5 g，置于已滅菌的培養(yǎng)皿并送至實驗室。

3.2 固氮菌的分離

3.2.1 直接法分離固氮菌

按無菌操作要求，在火焰上灼燒鑷子滅菌，冷卻后夾取米粒大土壤，均勻放置在固氮培養(yǎng)基平板上，并加0.1 mL無菌水在土壤上；正置10 min后，倒置放于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d。

3.2.2 梯度稀釋法分離固氮菌

按無菌操作要求，取5 g新鮮土壤加入50 mL無菌水中，振蕩混勻后靜置15 min，此液稀釋度為10-1；用移液槍吸取0.5 mL土壤上清懸液于第一支4.5 mL無菌水中，此液稀釋度為10-2；以此類推制成10-3、10-4幾種稀釋度的土壤稀釋液[7]；將各稀釋度的菌液用移液槍分別吸取0.2 mL于無氮培養(yǎng)基平板上，將三角推棒在酒精燈火焰上充分灼燒滅菌；冷卻后將懸液涂布均勻，正置3 min后，倒置放于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d。

3.3 純化固氮菌

觀察28 ℃培養(yǎng)3 d的固氮菌分離培養(yǎng)平板，用接種環(huán)挑取透明狀黏稠的褐色固氮菌可疑菌落于無氮培養(yǎng)基進行劃線分離，然后倒置放于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d;經(jīng)過鏡檢后，再將純化的固氮菌接種于固氮斜面培養(yǎng)基中，在28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d備用。

3.4 固氮菌的莢膜染色

取一片干凈載玻片，滴加一滴蒸餾水于載玻片中央，將接種環(huán)在酒精燈火焰上充分灼燒，冷卻后挑取少量固氮菌(菌不宜多)于蒸餾水滴中，充分分散菌體;放在37 ℃左右的培養(yǎng)箱干燥，干燥后滴加適量齊氏石炭酸復紅原液染液，使其覆蓋在固氮菌涂片表面，染色2～3 min后，用自來水緩慢沖洗染液至淡紅，用吸水紙把多余的水吸掉，使載玻片表面留有少量水分；從載玻片一端滴加1～2滴黑色碳素墨水溶液，輕輕晃動載玻片，使黑色碳素墨水溶液均勻分布于載玻片上，然后對準日光燈光照，將載玻片上的多余黑色碳素墨水溶液用吸水紙吸掉，讓光線能夠透過即可；最后在37 ℃左右的培養(yǎng)箱干燥后，油鏡下觀察菌體形態(tài)和莢膜特征。

4 實驗結果

4.1 直接法分離得到初步的固氮菌

將采集的土樣按上述方法進行分離，結果顯示可以得到初步分離的固氮菌(見圖1)。

圖1 直接法分離得到初步的固氮菌

4.2 梯度稀釋法分離得到初步的固氮菌

將采集土樣按梯度稀釋法進行分離后得到初步的固氮菌(見圖2)

圖2 梯度稀釋法分離得到初步的固氮菌

由圖2可看出：稀釋度為10-1時，菌落黏稠，表面光滑，分布較密集，部分菌落為淺褐色；稀釋度為10-2時，菌落黏稠，表面光滑，分布較稀疏，部分菌落為淺褐色；稀釋度為10-3，菌落黏稠，表面光滑，數(shù)量少，無褐色菌落；稀釋度為10-4，菌落黏稠，表面光滑，數(shù)量極少，無褐色菌落。

4.3 固氮菌的純化

將初步分離得到的固氮菌多次劃線分離后得到純的固氮菌(見圖3)。

圖3 劃線分離純化后的固氮菌

4.4 莢膜染色

改良后的莢膜染色，黑色背景較均勻，固氮菌菌體呈紅色，而莢膜不著色，可清晰地觀察到菌體呈“∞”型排列，見圖4。

圖4 固氮菌莢膜染色

5 討論

在現(xiàn)有的微生物學實驗課程中，細菌莢膜染色已作為微生物染色鏡檢技術中的一個重要組成部分被編入教學內(nèi)容中。在實際教學過程中，現(xiàn)有課程體系多為分章節(jié)針對性訓練，因此一般由教師提前為學生準備好菌種等材料，學生直接使用實驗菌培養(yǎng)物進行染色操作和觀察結果，因而學生對菌種來源不清楚。雖然微生物實驗課程中也有細菌分離純化等內(nèi)容的訓練[7]，但分離得到的細菌不會用于后續(xù)實驗內(nèi)容，這樣使課程內(nèi)容過于片段化，降低了課程內(nèi)容間的關聯(lián)和技能訓練的連續(xù)性。

開設的“從土壤中分離培養(yǎng)固氮菌及其莢膜染色”的綜合實驗，使學生親自參與土壤采集、固氮菌的分離、純化和莢膜染色等過程，并針對實驗具體細節(jié)進行一系列的改良和優(yōu)化。一是土壤采集的問題，固氮菌在干燥的土壤中不易存活，在實際課程開設過程中，若采土壤前下過雨，則可直接取土樣，并將樣本直接放在無氮培養(yǎng)基中培養(yǎng)，省去土壤濕潤及梯度稀釋法分離步驟，操作簡便快捷；如果采集的土壤為晴天且干燥，則取樣后將新鮮土壤用無菌水濕潤，并放在無氮培養(yǎng)基中培養(yǎng)或采用梯度稀釋法分離。二是分離時所用的無氮培養(yǎng)基平板要厚(體積約40 mL)，培養(yǎng)時能夠較長時間保持土壤濕潤，利于固氮菌的生長。三是在染色過程中，采用平鋪法代替原有的推片法，即輕輕晃動載玻片使黑色碳素墨水自然流動均勻鋪開，在光線下呈均勻半透明黑為宜。該改良后的方法染色背景均勻，色度適中，不會破壞菌膜表面，學生容易觀察到莢膜，新方法與傳統(tǒng)的推片法相比，操作更簡便、成功率高、效果更好，提高了微生物教學實驗的效率。

6 結語

綜合性實驗不僅包括了原有的莢膜染色內(nèi)容，還涉及到樣品采集、培養(yǎng)基配制和細菌分離純化等步驟[9-12]，且均由學生獨立完成，使學生綜合應用微生物知識的能力得到鍛煉，為其以后從事科研課題研究打下堅實的基礎。

通過開設固氮菌分離及其莢膜染色綜合性實驗，不僅提升學生的獨立實驗操作技能，而且培養(yǎng)了學生綜合應用微生物知識的能力，激發(fā)學生對微生物學習的積極性和主動性。

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