大鼠壓瘡局部不同干預溫度對內質網應激及細胞凋亡的影響

王 晴，杜曉菲，邢鳳梅，汪鳳蘭，張小麗

(華北理工大學護理與康復學院，河北 唐山 063000)

壓瘡是一種慢性皮膚潰瘍，常見于老年患者和長期臥床患者。壓瘡一旦發生，經久不愈，給病人帶來極大的痛苦，甚至會因繼發感染致全身衰竭而危及生命。據報道[1]，壓瘡會使老年患者的死亡率升高3倍。探索防治壓瘡的有效方法是國內外醫學研究的熱點之一。目前，關于壓瘡防治過程中如何對局部皮膚溫度進行干預，日益引起人們的重視。傳統的壓瘡治療方法，多為熱干預的方法，如使用烤燈、紅外線照射等。但近年的研究顯示[2]，熱療方法可能會加重壓瘡損傷，而進行冷干預具有良好效果。在壓瘡的防治中，冷、熱干預哪種方式更有效，尚未形成定論。目前認為，缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury，IRI)是壓瘡形成最主要的機制[3]，而在壓瘡形成過程中，局部組織由于受壓產生缺血、缺氧，氧自由基增多，鈣超載等病理現象，這些都會誘發內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)，過度的ERS可通過多種途徑誘導細胞凋亡，造成組織損傷[4]。本實驗通過對大鼠壓瘡局部分別進行冷、熱干預，觀察ERS相關蛋白的表達及其介導的細胞凋亡情況，比較不同溫度干預的治療效果，為臨床防治壓瘡提供基礎實驗依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性成年SD大鼠40只(質量為250～300 g)，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供 [SCXK (京) 2014-0004]。飼養于華北理工大學實驗動物中心 [SYXK (冀) 2015-0038]，飼養環境為：恒溫(18℃～24℃)，恒濕(45%～50%)，以及明暗交替各12 h。動物實驗符合校動物倫理管理委員會的規定(15-098)，實驗過程嚴格遵守實驗動物使用的3R原則。

1.2 主要試劑與儀器

兔源GRP78單克隆抗體(美國Cell Signaling Technology)，兔源CHOP單克隆抗體(美國Cell Signaling Technology)，兔源caspase-12單克隆抗體(英國Abcam公司)，兔源GAPDH單克隆抗體(美國Cell Signaling Technology)，FITC熒光素標記羊抗兔IgG (H+L)(美國KPL公司)，TUNEL試劑盒(美國Chemicon公司)。

酶標儀(美國Thermo Scientific公司)，電泳儀(北京六一儀器廠)，電轉儀(北京六一儀器廠)，壓瘡裝置(唐山鼓風機器械制造廠)，自制恒溫箱。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物模型裝置制作

圖1 壓瘡造模示意圖Fig.1 The pressure ulcer modeling device

(1)壓瘡裝置：根據姜麗萍等[5]的方法設計壓瘡裝置。該裝置主要由固定支架、施壓柱(其頭端為圓形底面，其半徑0.5 cm)以及泡沫板組成(見圖1)。已知造模過程中需保持大鼠受壓的部位和壓強不變，因施壓柱頭端底面面積一定，通過在上面增減砝碼便可達到受壓部位所需壓強。

(2)恒溫箱：該裝置主要由溫度計、泡沫箱組成，在泡沫箱頂端設置通風孔，可使外界空氣與箱內空氣相通(見圖2)。可通過在泡沫箱內放置冰袋或熱水袋來改變箱內溫度，使其變成預期溫度Δt。使用時，將大鼠受壓部位放入箱內，并根據溫度計的變化隨時打開通風孔對箱內溫度進行調整，使箱內溫度始終保持在(Δt±1) ℃。

1.3.2 大鼠壓瘡模型的制備

根據姜麗萍等[5]的方法建立大鼠壓瘡缺血再灌注損傷模型。使用10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)對大鼠腹腔注射，麻醉后側臥位固定，在大鼠一側大腿股薄肌處剪毛，使皮膚暴露，在此處施加170 mmHg(22.47 kPa)的壓力。造模過程為5個循環，每個循環包括缺血(施壓)2 h，再灌注(放松)0.5 h。造模時，將實驗環境溫度保持在22℃，為保證大鼠的麻醉狀態按需補充麻藥。

圖2 溫度干預示意圖Fig.2 The temperature intervention device

1.3.3 實驗分組及處理方法

將40只SPF級雄性成年SD大鼠隨機分成sham組、模型組、熱干預組和冷干預組4組，按如下方法處理：

(1)Sham組(10只)：只麻醉，不做處理。

(2)模型組(10只)：麻醉后，在常溫(22℃)下實施5個缺血再灌注循環。

(3)冷干預組(10只)：將常溫22℃設為Δt，熱干預溫度=(Δt-10)℃=12℃。將大鼠麻醉后實施5個缺血再灌注循環，其中每個循環的缺血階段(1 h)在常溫下進行，再灌注階段(0.5 h)需將受壓部位放入溫度保持在12℃的恒溫箱中。

(4)熱干預組(10只)：將常溫設為Δt，熱干預溫度=(Δt + 10) ℃=32℃。將大鼠麻醉后實施5個缺血再灌注循環，每個循環的缺血階段(2 h)在常溫下進行，再灌注階段(0.5 h)需將受壓部位放入溫度保持在32℃的恒溫箱中。

冷干預組和熱干預組的溫度參考Lee等[6]的實驗方法設置，但由于二者實驗方案不同，本實驗在其基礎上做了些許改動。

1.3.4 檢測方法

在實驗終點于冰上剪取各組大鼠受壓部位肌肉組織，放入4℃生理鹽水中洗凈血液，用濾紙吸干水分，取大小為0.5 cm × 0.5 cm × 0.5 cm的組織放于4%多聚甲醛中固定，用于制備石蠟切片，進行組織形態學觀察、免疫熒光檢測以及細胞凋亡的檢測；另取500 mg組織放于-80℃超低溫冰箱保存，用于Western blot檢測。

(1)HE染色檢測骨骼肌的病理變化：取適量肌肉組織，用4%多聚甲醛固定后，制備骨骼肌組織石蠟切片。烤片，脫蠟，蘇木素染核，鹽酸酒精分化，入水返藍，加伊紅染色，水洗并鏡下觀察，脫水，透明，中性樹膠封片。

(2)Western blot檢測GRP78、caspase-12與CHOP蛋白的表達水平：取適量肌肉組織，提取蛋白，計算濃度，確定上樣量，分裝、變性。制備SDS-PAGE凝膠，蛋白上樣，電泳并轉膜。將轉入蛋白的膜用5%脫脂牛奶封閉，加一抗后4℃過夜。次日用TBST緩沖液洗膜，加入相應的二抗，37℃孵育1～2 h。再次洗膜，顯色，通過Image J軟件分析各組條帶的灰度值。

(3)免疫熒光檢測caspase-12與CHOP的表達水平：取適量肌肉組織，用4%多聚甲醛固定后，制備心肌組織石蠟切片。烤片，脫蠟，用檸檬酸鈉熱修復，3% H2O2滅活內源性酶，用10%山羊血清封閉后加一抗，4℃濕盒過夜。次日加熒光標記二抗，37℃暗濕盒0.5 h，PBS沖洗，DAPI染核，再次沖洗后封片，在熒光顯微鏡下觀察。

(4)TUNEL檢測細胞的凋亡情況：采用Chemicon公司的TUNEL凋亡檢測試劑盒，按照試劑盒說明書進行操作。光鏡下觀察染色結果并拍照計數。陽性表現為細胞核染色質固縮，成棕褐色。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 HE染色檢測大鼠受壓部位骨骼肌的病理變化結果

HE染色結果顯示，sham組肌纖維形態正常，排列緊密，結構清晰，無明顯炎性細胞浸潤；模型組肌纖維間質增寬，排列紊亂，部分出現明顯的斷裂、溶解，間隙處有明顯的炎性細胞浸潤；熱干預組與模型組相比損傷程度加重，大部分肌纖維溶解、斷裂，出現玻璃樣改變，炎性細胞浸潤增多；冷干預組與模型組相比損傷減輕，肌纖維排列較為整齊，出現的溶解、斷裂較少，炎性細胞浸潤較少(見圖3)。

注：A：Sham組；B：模型組；C：熱干預組；D：冷干預組。圖3 各組骨骼肌HE染色病理變化(× 200)Note. A: Sham group; B: Model group; C: High-temperature intervention group; D: Low-temperature intervention group.Fig.3 Pathological changes of the skeletal muscle tissues in the rats. HE staining

2.2 Western blot檢測大鼠受壓部位GRP78、caspase-12與CHOP蛋白的表達結果

與sham組相比，模型組GRP78、caspase-12與CHOP表達均顯著增加(P< 0.05)；與模型組相比，熱干預組三種因子的表達水平進一步升高(P< 0.05)，而冷干預組的表達水平有所下降(圖4)。

注：A：蛋白GRP78、caspase-12和CHOP的Western blot檢測結果；B、C、D：分別為GRP78、caspase-12和CHOP的Western blot檢測結果柱形圖。1：Sham組；2：模型組；3：熱干預組；4：冷干預組。與sham組相比，*P< 0.05；與模型組相比，#P< 0.05。圖4 Western blot檢測各組GRP78、caspase-12和CHOP的表達水平Note. A: Electrophoretic map of the proteins. B, C, D: Histograms of the protein expressions. 1: Sham group; 2: Model group; 3: High-temperature intervention group; 4: Low-temperature intervention group. Compared with the sham group,* P< 0.05. Compared with the model group,# P< 0.05.Fig.4 Expression levels of GRP78, caspase-12 and CHOP proteins in the pressure ulcer tissues of the rats detected by Western blot

2.3 免疫熒光檢測大鼠受壓部位骨骼肌細胞的凋亡情況

免疫熒光結果顯示，sham組幾乎檢測不到caspase-12與CHOP的熒光表達；模型組兩種因子的表達量均明顯增加，且主要表達在細胞漿內。與模型組相比，兩種因子在熱干預組的熒光表達量進一步增加，而在冷干預組有所減少(見圖5、圖6)。

注：A：Sham組；B：模型組；C：熱干預組；D：冷干預組。圖5 免疫熒光檢測各組CHOP的表達(× 400)Note. A: Sham group; B: Model group; C: High-temperature intervention group; D: Low-temperature intervention group.Fig.5 Expression of CHOP in the pressure ulcer tissues of rats detected by immunofluorescence assay

注：A：Sham組；B：模型組；C：熱干預組；D：冷干預組。圖6 免疫熒光檢測各組caspase-12的表達(× 400)Note. A: Sham group; B: Model group; C: High-temperature intervention group; D: Low-temperature intervention group.Fig.6 Expression of caspase-12 in the pressure ulcer tissues of the rats detected by immunofluorescence assay

2.4 TUNEL染色檢測大鼠受壓部位骨骼肌細胞的凋亡情況

TUNEL染色結果顯示，sham組僅有少數陽性染色細胞核，模型組陽性細胞數顯著增加。與模型組相比，凋亡細胞數在熱干預組進一步增加，而在冷干預組有所減少(見圖7、圖8)。

注：A：Sham組；B：模型組；C：熱干預組；D：冷干預組。箭頭指示凋亡細胞。圖7 TUNEL檢測各組骨骼肌細胞凋亡情況(× 200)Note. A: Sham group; B: Model group; C: High-temperature intervention group; D: Low-temperature intervention group. Arrows indicate apoptotic cells.Fig.7 Cell apoptosis in the pressure ulcer tissues of rats detected by TUNEL assay

注：A：Sham組；B：模型組；C：熱干預組；D：冷干預組。與sham組相比，*P< 0.05；與模型組相比，#P< 0.05。圖8 TUNEL檢測各組凋亡細胞數量Note. A: Sham group; B: Model group; C: High-temperature intervention group; D: Low-temperature intervention group. Compared with the sham group,*P< 0.05. Compared with the model group,#P< 0.05.Fig.8 Number of apoptotic cells in the pressure ulcer tissues of the rats detected by TUNEL assay

3 討論

近年研究顯示[3]，缺血再灌注損傷是壓瘡形成最主要的機制，而其誘導的深部組織損傷(deep tissue injury，DTI)是壓瘡發展的重要原因，因此本實驗以肌肉組織為中心研究壓瘡損傷。骨骼肌和其他組織不同，細胞內含有豐富的內質網，負責蛋白質合成、儲存鈣離子等[7]。在壓瘡形成過程中，局部組織由于受壓產生缺血、缺氧，氧自由基增多，鈣超載等病理現象，骨骼肌細胞受到這些病理因素刺激致使內質網穩態失衡，形成內質網應激(ERS)。而過度的ERS會通過活化相關因子介導凋亡途徑而導致細胞死亡[2]。因此，抑制ERS介導的細胞凋亡成為減輕壓瘡損傷的關鍵。

過去在臨床防治壓瘡時，多應用局部熱干預，在《基礎護理學》教材中寫到[8]：對Ⅱ期壓瘡用紅外線照射瘡面，Ⅲ期壓瘡應用鵝頸燈照射，通過促進受壓部位血液循環，提高細胞功能來減少組織損傷。但近些年的研究顯示[2]：當受壓區域溫度升高時，會增加局部組織的代謝氧需要量，從而增加壓瘡的易發性。相反，降低局部溫度可通過降低組織代謝，減少需氧量，抑制炎性因子擴散等來減輕缺血再灌注損傷[6]。近來陸續有研究顯示[9-11]，在壓瘡的防治過程中，應用局部冷干預具有良好的效果。目前關于壓瘡溫度干預的研究大多為臨床上的研究，通過基礎實驗獲得的理論支持不足。因此，通過對ERS相關蛋白及其介導的細胞凋亡的研究，對比局部冷、熱干預對大鼠壓瘡的治療效果，為臨床防治壓瘡提供依據。

本實驗HE和TUNEL結果顯示，模型組骨骼肌損傷嚴重，出現大量凋亡細胞，說明造模成功。而冷干預組與模型組相比損傷減輕，凋亡細胞減少，說明降低局部溫度可減輕壓瘡缺血再灌注損傷，這與Lee等[6]的研究結果相同。熱干預組與模型組相比損傷加重，說明局部溫度升高會加重壓瘡組織的損傷。

為了進一步探討各組大鼠壓瘡組織中內質網應激介導凋亡的情況，本實驗研究了ERS相關蛋白GRP78、caspase-12與CHOP的表達情況。GRP78是內質網分子伴侶，正常情況下與跨膜蛋白結合以維持內質網穩態，對內質網內環境極度敏感，當內質網穩態被破壞，即發生ERS時，GRP78會與跨膜蛋白解離而表達增高[12]。因此，GRP78作為內質網應激的標志性蛋白，一定程度上反映ERS的程度。在本實驗中，模型組GRP78蛋白表達高于sham組，表明壓瘡缺血再灌注損傷會破壞內質網穩態，誘發ERS，這與Koyama等[13]的研究結果一致。與模型組相比，熱處理組GRP78蛋白表達進一步上升，表明局部熱處理會加重ERS反應程度；而冷處理組GRP78表達有所下降，說明局部冷處理會在一定程度上抑制ERS反應，這與高宇等[14]的研究結果相同。

研究表明[4]，適度的ERS可促進內質網穩態的恢復，增加細胞對刺激的耐受力，但持續而嚴重的ERS會通過多種途徑誘導細胞凋亡，造成細胞損傷。在這個過程中，CHOP、caspase-12起關鍵作用。CHOP是ERS早期凋亡相關轉錄因子，在多條ERS介導的凋亡通路中充當下游凋亡信號分子，可阻滯細胞分裂誘導細胞凋亡。因此，CHOP一定程度上可反映ERS介導的細胞凋亡水平[7]。caspase-12以酶原的形式定位于內質網外膜，產生于內質網，在發生ERS時被激活，是內質網應激特異性的凋亡因子[15]。這兩種因子介導了ERS誘導的凋亡途徑，在壓瘡的發生發展中起重要作用。

Western blot和免疫熒光結果顯示，與sham組相比，模型組能夠顯著上調CHOP、caspase-12的表達，說明壓瘡損傷誘發內質網應激，介導凋亡通路生成，引起骨骼肌細胞凋亡；而局部熱干預使這兩種因子的表達在模型組的基礎上進一步升高，說明溫度升高可能會因加劇ERS而促進細胞凋亡的發生；經局部冷干預后，壓瘡組織中CHOP、caspase-12的表達水平下降，說明冷干預會抑制細胞凋亡的進展，這可能與低溫抑制ERS有關。

綜上，本實驗結果顯示，局部冷干預可能通過抑制內質網應激介導的凋亡通路而減輕大鼠壓瘡損傷；與之相反，局部熱干預可能會因加劇ERS而促進細胞凋亡的發生，進而加重大鼠壓瘡損傷。因此，在對壓瘡的臨床防治過程中，可能不宜使用熱干預方法，使用冷干預可能會有良好效果。

[1] Tannen A, Dassen T, Halfens R. Differences in prevalence of pressure ulcers between the Netherlands and Germany—associations between risk, prevention and occurrence of pressure ulcers in hospitals and nursing homes [J]. J Clin Nurs, 2008, 17(9): 1237-1244.

[2] Jan YK, Liao F, Rice LA, et al. Using reactive hyperemia to assess the efficacy of local cooling on reducing sacral skin ischemia under surface pressure in people with spinal cord injury: a preliminary report [J]. Arch Phys Med Rehabil, 2013, 94(10): 1982-1989.

[3] Kendall AC, Whatmore JL, Harries LW, et al. Changes in inflammatory gene expression induced by hyperbaric oxygen treatment in human endothelial cells under chronic wound conditions [J]. Exp Cell Res, 2012, 318(3): 207-216.

[4] 張春雪, 閔鶴鳴, 閔連秋. 2-脫氧葡萄糖誘導大鼠內質網應激預處理模型的最佳劑量 [J]. 中國實驗動物學報, 2011, 19(1): 74-78, 98.

[5] 蔡福滿, 姜麗萍, 楊曄琴, 等. 褥瘡不完全性缺血再灌注損傷簡易模型的建立 [J]. 中國病理生理雜志, 2009, 25(4): 830-832.

[6] Lee B, Benyajati S, Woods JA, et al. Effect of local cooling on pro-inflammatory cytokines and blood flow of the skin under surface pressure in rats: feasibility study [J]. J Tissue Viability, 2014, 23(2): 69-77.

[7] Sano R, Reed JC. ER stress-induced cell death mechanisms [J]. Biochim Biophys Acta, 2013, 1833(12): 3460-3470.

[8] 殷磊. 護理學基礎 [M]. 北京: 人民衛生出版社, 2002: 221.

[9] 曹燕, 錢丹, 蔡亞萍, 等. 醫用降溫貼對重癥監護室病人壓瘡的預防作用 [J]. 護理研究, 2015, 29(9): 1120-1121.

[10] 王莉, 曾俊, 劉娟, 等. 低溫碘伏治療手術體位致壓瘡效果觀察 [J]. 護理學雜志, 2014, 29(4): 47-48.

[11] Tzen YT, Brienza DM, Karg PE, et al. Effectiveness of local cooling for enhancing tissue ischemia tolerance in people with spinal cord injury [J]. J Spinal Cord Med, 2013, 36(4): 357-364.

[12] 陳凱, 張承英, 李建民, 等. 纈沙坦對糖尿病大鼠腎臟中內質網應激及炎癥反應的抑制作用 [J]. 中國實驗動物學報, 2015, 23(2): 132-138.

[13] Koyama M, Furuhashi M, Ishimura S, et al. Reduction of endoplasmic reticulum stress by 4-phenylbutyric acid prevents the development of hypoxia-induced pulmonary arterial hypertension [J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2014, 306(9): H1314-H1323.

[14] 高宇, 金利, 吳淋, 等. 低溫對大鼠全腦缺血再灌注時海馬內質網應激的影響 [J]. 中華麻醉學雜志, 2015, 35(9): 1146-1149.

[15] Dalal S, Zha Q, Daniels CR, et al. Osteopontin stimulates apoptosis in adult cardiac myocytes via the involvement of CD44 receptors, mitochondrial death pathway, and endoplasmic reticulum stress [J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2014, 306(8): H1182-H1191.