大鼠門靜脈高壓對血清內毒素及腸黏膜的影響分析

李曉娟，張巧云，馮 帆，姜棋予，柴燕濤，李 潤，侯 俊*，李瑞生*

(1.解放軍第302醫院臨床研究管理中心，北京 100039； 2.山東省蓬萊市中醫醫院檢驗科，山東 蓬萊 265600)

門脈高壓和內毒素血癥是肝硬化晚期最常見的并發癥[1]。內毒素(endotoxin，ET)是革蘭氏陰性菌細胞壁上的脂多糖，可通過多種途徑介導機體損傷[2]。當肝硬化形成時，肝內組織結構發生改變導致肝臟枯否細胞對內毒素的清除下降。同時門脈高壓形成后致側枝循環開放，也使內毒素在肝內的清除下降，上述這兩種原因均導致內毒素可以繞過肝臟直接進入體循環[3]。目前研究表明腸道除了具有消化吸收功能之外，還具有內分泌、免疫和屏障功能，而肝功能正常與否與腸源性內毒素血癥的發生密切相關[4]，尤其肝腸相互作用軸已成為目前研究的熱點，假設腸粘膜屏障功能障礙，會加重腸道微生態平衡的破壞及機體免疫功能的損害[5-6]。因此本實驗利用SD大鼠構建肝臟功能正常基礎上的單純性門脈高壓模型，分別取不同時間點檢測血清內毒素的變化以及腸道病理的變化，旨在分析在單純性門脈高壓的情況下，內毒素和腸道通透性的變化情況，以期為肝硬化腸肝互作的研究提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

動物選擇軍事醫學科學院實驗動物中心SPF級SD大鼠16只，雄性，單鼠體質量190～200 g [SCXK (軍) 2012-004]。飼養室溫度22℃～23℃，環境濕度50%，自由進食和飲水 [SYXK (軍) 2012-010]。

1.2 主要試劑與儀器

大鼠內毒素ELISA試劑盒(科晶生物，KJ-1908)；水合氯醛(國藥集團化學試劑有限公司，20151023)。顯微外科手術器械；K10CD型干浴恒溫箱(杭州奧盛儀器有限公司)；TD型電子天平(余姚市金諾天平有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物模型制備

實驗分別取4只大鼠作為空白對照組，12只大鼠作為門脈部分結扎模型組。模型構建：在無菌條件下，使用水合氯醛(濃度為10%)進行麻醉，注射劑量為每只0.7 mL，待大鼠進入深麻醉狀態，作劍突下正中切口2.0～3.0 cm，將肝臟輕輕向上翻起，將胃腸輕輕向右撥開，放置于生理鹽水浸潤的紗布上可以清晰的看到門靜脈的位置。鈍性分離門靜脈，在門靜脈外緣平行放置2根外徑為0.8 mm的平頭空心管，用4/0絲線結扎門靜脈主干和與之并行的鈍性針頭，結扎完后，輕輕拔出平頭空心管，關腹。對照組作假手術僅游離門靜脈，臟器復位后分層關腹。實驗過程中均遵循3R原則，對動物實施人道主義關懷。

1.3.2 內毒素測定

首先通過大鼠眶后靜脈叢采集空白對照組大鼠血液，隨后分別在3 d、7 d、10 d采集模型組大鼠血液，室溫靜置30 min，離心取血清，用ELISA法檢測血清中內毒素的結果，每個樣本均進行3個復孔檢測。所有實驗器材均采用去熱原處理。

1.3.3 腸道病理檢查

空白對照組在首次采集完血液后，模型組分別在3 d、7 d、10 d采集血液后，處死大鼠，分別采集空腸、回腸、結腸。用4%甲醛溶液固定，常規脫水、石蠟包埋、切片和HE染色，光學顯微鏡下行病理組織形態學觀察[7]，根據病理切片結果對不同部位腸黏膜的變化過程進行分析。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 大鼠門脈部分結扎模型構建及一般狀態

12只模型組大鼠均成功分離出門靜脈，并進行門靜脈部分結扎手術(見圖1)。術后大鼠一般狀況均良好，飲食正常，隨著時間的推移也未出現各種不適以及精神萎靡的狀況。

2.2 不同時間點大鼠內毒素的變化

空白對照組和模型組(3 d、7 d、10 d)每只大鼠的樣本均進行3孔重復，得出每個樣本的內毒素均數。然后各組相互之間進行統計學分析，結果顯示，各模型組血清內毒素的結果與正常對照組之間差異無顯著性(見表1)。

注：A：麻醉剖腹探查門靜脈；B：鈍性分離門靜脈；C：部分結扎門靜脈。圖1 大鼠門脈部分結扎模型Note. A: Exploration of the portal vein by laparotomy after anesthesia. B: Blunt separation of the portal vein. C: Partial ligation of the portal vein.Fig.1 Partial portal vein ligation in a rat

組別Groups正常組Normalgroup模型組(3d)Modelgroup(3d)模型組(7d)Modelgroup(7d)模型組(10d)Modelgroup(10d)內毒素含量Endotoxinlevels5114±2624319±8054364±5294160±764

注：箭頭所指為黏膜脫落部位。圖2 大鼠不同時間點空、回、結腸病理學結果(HE染色，× 10)Note. Arrows indicate the abscission sites of epithelial cells in the intestinal mucosa.Fig.2 Histopathological changes of the jejunum, ileum and colon at different time points in the rats of different groups. HE staining

2.3 不同時間點大鼠腸道病理組織學結果

病理組織學觀察結果表明：空白對照組大鼠空腸、回腸和結腸的病理組織結構整齊，粘膜分層規則清晰，各層結構完整，上皮細胞與固有層間連結緊密無縫隙；成模3 d后各腸段的粘膜層次依然較整齊清晰，上皮與固有層的連接還未出現縫隙；而成模7 d后各腸段較3 d粘膜層的局部腸絨毛出現了部分破壞和腫脹，上皮細胞與固有層間連結出現了松散的狀況；成模10 d較3 d和7 d的腸黏膜發生了較大的損傷：腸絨毛排列凌亂，部分腫脹溶解，粘膜上皮細胞可見萎縮脫落。黏膜下炎癥細胞浸潤增多，上皮細胞與固有層的間距可見明顯增寬；而固有層腺體明顯減少及破壞。

3 討論

在正常情況下，腸黏膜屏障在保持機體內環境穩定方面發揮了重要作用，腸黏膜能夠阻止腸道細菌、內毒素向腸外移位，保護機體免受食物抗原、微生物及其有害代謝產物的損害[8]。而當肝硬化尤其是出現門脈高壓合并腹水時，腸黏膜屏障系統也會隨之發生功能改變。徐義軍等[9]發現當腸道通透性顯著增加后，早期即可出現細菌移位并形成內毒素血癥。施琳琳等[10]也驗證了應用中藥大黃可以改善由于肝硬化導致內毒素滅活減少，腸免疫功能紊亂而導致的腸道菌群異常增生和腸源性內毒素吸收增加形成的腸源性內毒素血癥。而在肝功能正常狀態下形成門脈高壓以觀察內毒素和腸黏膜改變的研究尚未報道。

因此本實驗應用SD大鼠構建肝臟功能正常的單純性門脈高壓模型，分別取不同時間點檢測血清內毒素的變化情況以及胃腸道病理變化情況，結果顯示，模型組大鼠均成功構建了門脈部分結扎模型。術后大鼠一般狀況均良好，飲食正常，隨著時間的推移也未出現各種不適以及精神萎靡的狀況。此法與王繼見等[11]使用Wistar大鼠構建門脈部分結扎模型相似，此法操作簡便、快速，成模時間短，且能對門靜脈部分結扎后到形成門脈高壓期間檢測的各項指標進行動態觀察。本實驗對不同時間點的血清內毒素進行檢測結果顯示，不同時間點內毒素差異無顯著性。經過分析發現，肝臟作為體內清除內毒素和解毒的主要臟器，是遭受內毒素攻擊的首要器官。而在正常情況下，肝臟具有很強的內毒素滅活能力，由此看出，肝臟正常時可以將來自門靜脈的內毒素完全滅活，因而不會發生內毒素血癥。若肝臟受損如肝硬化時，對內毒素的滅活能力下降，則容易發生腸源性內毒素血癥[12]。因此推斷在本實驗的操作過程中，由于肝臟功能未受損，內毒素的升高還未超出肝臟處理內毒素的上限，因此內毒素未出現很大的波動。但是不同部位腸段的病理結果顯示，成模3 d后各腸段也未發生很大的損傷，成模7 d后各腸段局部腸絨毛出現了部分破壞和腫脹，上皮細胞與固有層間連結出現了松散的狀況；成模10 d較3 d和7 d腸段均出現了明顯的損傷。腸粘膜屏障是由機械屏障、化學屏障、生物屏障以及免疫屏障共同構成。在腸粘膜機械屏障組成成分中，腸上皮細胞及其緊密連接是最重要的組成部分[13-14]。因此本實驗單純門脈高壓可以造成腸黏膜出現損傷，如果繼續發展將會使進入門靜脈的內毒素不斷增加，最終如果超出了肝臟的清理能力，就可能會逆流入血形成內毒素血癥，這一點有待進一步實驗驗證。

綜上所述，本實驗通過單純制造門脈高壓模型檢測內毒素和腸黏膜變化情況發現，在短時間內，在肝功能正常的情況下，門脈高壓可以造成腸黏膜的損傷，而腸道產生的內毒素不會很快超出肝臟的處理能力而出現血清內毒素升高的現象，為今后研究肝硬化門脈高壓與內毒素血癥和腸黏膜損傷的發病機制提供一定的理論依據。

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