棕背鼠平性別的快速鑒定

馬 芹，王元智，陸濤峰，李智昊，楊春文，陳洪巖*

(1.中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所，黑龍江省實驗動物與比較醫學重點實驗室，哈爾濱 150009； 2.牡丹江師范學院，黑龍江 牡丹江 157011)

在野生嚙齒類動物棕背鼠 平(Myodesrufocanus)的生態學研究中，對其進行性別鑒別是分析其種群動態的一項基本工作[1]。因棕背鼠 平是流行性出血熱病毒、森林腦炎病毒及普馬拉病毒等人獸共患病病原體的天然宿主[2-3]，本實驗室已開展棕背鼠 平的實驗室繁育[4]，擬將其培育成實驗動物，以便構建人獸共患病感染動物模型，同時豐富實驗動物資源。但在其實驗室繁育過程中，因其性別不易判斷，嚴重影響著分籠與繁殖。目前對棕背鼠 平的性別鑒定多依據肛門到尿生殖孔的距離及被毛、性情、乳頭及外部生殖器官等指標[5-6]進行判斷(圖1)，但棕背鼠 平活動敏捷、性情不溫順，不易抓取；幼齡時期的棕背鼠 平外部生殖器官又未顯現，不能從外表準確區分雌雄；從肛門到尿生殖孔的距離及被毛進行觀察，主觀性較強，很難做到正確的性別分離。

注：A：4周齡；B：成年雄性；C：成年雌性。圖1 棕背鼠 平性別的表型判斷Note. A: A 4-week-old grey red-backed vole; B: An adult male grey red-backed vole; C: An adult female grey red-backed vole.Fig.1 Phenotypic identification of the gender of grey red-backed voles

隨著對性別決定理論的深度研究，用于動物性別鑒定的方法也在同步發展，尤其在分子生物學領域取得了較大進展。Page等[7]發現在Y染色體上存在一種可編碼鋅指蛋白的高度保守的基因序列，即鋅指結構基因(zinc-finger Y，ZFY)，該序列可能與性別決定有關；Schneider-G?dicke[8]在哺乳動物X染色體上也發現了與ZFY高度同源的基因，即ZFX基因，在無ZFY表達的小鼠上，睪丸的分化不受影響，因此，ZFY/ZFX基因不能決定性別。Sinclair等[9]發現在Y染色體短臂靠近常染色體的35 kb區域存在性別決定區(sex-determining region of the Y chromosome)，即SRY基因。Koopman等[10]將SRY基因注入到雌性小鼠胚胎中，后期小鼠發育成雄性，證明了SRY基因為哺乳動物的性別決定基因。目前已在東北虎、黑熊、貓、牛等動物[1, 11-13]上用SRY基因進行了性別鑒定，正確率100%。本實驗在棕背鼠 平實驗室繁育研究[4]的基礎上，利用PCR技術，以棕背鼠 平的新鮮毛囊為實驗材料，從毛囊中提取DNA，利用SRY基因和ZFY/ZFX基因的雙重PCR擴增對棕背鼠 平的性別進行鑒定，建立一種快速、準確、簡便的性別鑒定方法。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

于黑龍江省牡丹江地區牡丹峰林地捕獲的野生棕背鼠 平若干只，經隔離檢疫后，飼養在中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所負壓隔離環境感染動物實驗設施內 [SYXK (黑) 2017-009]，選取6只雄性成年、3只雌性成年及14只4周齡左右棕背鼠 平用于PCR方法鑒定棕背鼠 平性別；10只SPF級Wistar大鼠(5只雄性，體重310～320 g；5只雌性，體重230～240 g；9周齡)和8只SPF級BALB/c小鼠(5只雌性和3只雄性，體重21～23 g，6周齡)，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司 [SCXK (京) 2016-0011]，飼養在中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所負壓隔離環境感染動物實驗設施內。實驗過程中按實驗動物使用的3R原則給予人道主義關懷。

1.2 主要試劑與儀器

Chelex-100 resin購于Sigma公司，蛋白酶K和2× EasyTaq SuperMix購于全式金生物技術有限公司，PCR儀購于杭州博日科技有限公司，DK-8D型電熱恒溫水槽購于上海精宏實驗有限公司，凝膠成像分析系統購于北京賽智創業科技有限公司，其他常規試劑為分析純。

1.3 實驗方法

1.3.1 棕背鼠 平基因組DNA的提取

用鑷子夾取棕背鼠 平被毛，挑選帶有毛囊的5根，保留被毛根部，剪去其余部分，放入0.5 mL EP管中，加入0.3 mL ddH2O洗一次，然后加入30 μL 5%的Chelex-100和5 μL 5 mg/mL的蛋白酶K，置于56℃恒溫水浴保溫6 h。取出后振蕩，100℃保溫8 min，充分振蕩，13 000 r/min離心3 min，DNA存在于上清中，-20℃保存上清備用。

1.3.2 引物合成

[14]設計并合成擴增ZFY/ZFX基因片段的引物：P1∶5’-ATAATCACATGGAGAGCCACAA GCT-3’，P2∶5’-GCACTTCTTTGGTATCTGAGAAA GT-3’；針對鼠的SRY基因設計并合成用于性別鑒定的引物：P3∶5’-TGTGGTCTCGTGGTCAGAGG-3’，P4∶5’-CGGCTTCTGTAAGGCGTTTC-3’。引物均由哈爾濱博仕生物技術有限公司合成。

1.3.3 PCR擴增

以提取的毛囊DNA為模板，分別構建ZFY/ZFX基因和SRY基因PCR擴增體系50 μL：2× EasyTaq PCR SuperMix 25 μL，DNA模板1 μg，P1(P3)引物1 μL，P2(P4)引物1 μL，ddH2O 22 μL。反應程序為94℃預變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸60 s，35個循環；72℃延伸10 min。擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，擴增條帶大小與目的條帶一致時進行測序分析。

1.3.4 雙重PCR擴增

將擴增ZFY/ZFX基因和SRY基因的引物同時加入到一個PCR反應體系內，建立雙重PCR擴增方法。擴增體系為：2× EasyTaq PCR SuperMix 25 μL，DNA模板1 μg，P1引物1 μL，P2引物1 μL，P3引物0.6 μL，P4引物0.6 μL，ddH2O 20.6 μL。反應程序同PCR擴增。同時優化退火溫度、引物濃度及瓊脂糖凝膠濃度，確定最佳的雙重PCR擴增條件。當擴增片段僅有一個(ZFY/ZFX445/447 bp)時，說明該棕背鼠 平不存在SRY基因位點，性別為雌性；當擴增片段有兩個(ZFY/ZFX445/447 bp和SRY108 bp)時，說明該棕背鼠 平的性別為雄性；當沒有擴增片段時，說明PCR擴增體系構建失敗，不能對棕背鼠 平的性別進行鑒定。

1.3.5 性別鑒定

選取23只棕背鼠 平(表型判斷為6只雄性，3只雌性，其余鼠性別經解剖結果進行判斷)、10只Wistar大鼠(5只雄性，5只雌性)和8只BALB/c小鼠(3只雄性，5只雌性)，獲取其帶有毛囊的新鮮被毛，Chelex-100提取基因組DNA。利用上述建立的雙重PCR擴增方法進行性別鑒定。

2 結果

2.1 PCR擴增

選取雄性、雌性棕背鼠 平各一只，利用Chelex-100提取毛囊中DNA，分別以雄、雌DNA為模板，P1和P2為引物建立PCR反應體系，擴增ZFY/ZFX基因片段，產物經瓊脂糖凝膠電泳顯示，雌、雄性棕背鼠 平均有擴增條帶(圖2)，片段大小與ZFY/ZFX目的片段一致，經測序后分析為ZFX基因。同時，以P3和P4為引物，擴增SRY基因片段，結果顯示雄性有與SRY基因目的片段大小一致的條帶，測序分析為鼠的SRY基因，而雌性未擴增出條帶(圖2)。

注：M：DL 2000 DNA Marker；泳道1和2：ZFY/ZFX基因擴增；泳道3和4：SRY基因擴增。泳道1和3：雌性棕背鼠 平；泳道2和4：雄性棕背鼠 平。圖2 棕背鼠 平SRY基因和ZFY/ZFX基因的PCR擴增結果Note. M: DL 2000 DNA Marker; Lane 1 and 2: PCR products of the ZFY/ZFX gene; Lane 3 and 4: PCR products of the SRY gene. Lane 1 and 3: Female voles; Lane 2 and 4: Male voles.Fig.2 PCR amplification products of the SRY and ZFY/ZFX genes in grey red-backed voles

2.2 雙重PCR擴增

分別以雄性、雌性棕背鼠 平毛囊DNA為模板，構建ZFY/ZFX基因和SRY基因雙重PCR擴增體系，結果顯示雄性可擴增出兩條片段(ZFX445 bp和SRY108 bp)；而雌性只擴增出一條片段(ZFX445 bp)，未擴增出SRY基因片段；陰性對照無條帶(圖3)。實驗重復操作3次，擴增結果一致，穩定性較好，雙重PCR擴增體系構建成功。通過對擴增條件的優化，退火溫度為55℃時擴增的PCR產物在3%瓊脂糖凝膠電泳下觀察效果最佳。

注：M：DL 2000 DNA Marker；泳道1～3：分別為陰性對照、雄性棕背鼠 平、雌性棕背鼠 平。圖3 雌、雄性棕背鼠 平SRY基因和ZFY/ZFX基因的雙重PCR擴增結果Note. M: DL 2000 DNA Marker; Lane 1-3: Negative control, male and female grey red-backed voles, respectively.Fig.3 Amplification products of the SRY and ZFY/ZFX genes in male and female grey red-backed voles by the double PCR assay

2.3 性別鑒定

獲取23只棕背鼠 平、10只Wistar大鼠及8只BALB/c小鼠的新鮮毛囊，提取基因組DNA，利用本實驗建立的ZFY/ZFX基因和SRY基因雙重PCR擴增方法，對23只棕背鼠 平進行性別鑒定，結果(圖4)顯示前9只已知性別的棕背鼠 平檢測結果與表型判斷

一致，其中6只同時擴增出ZFY/ZFX基因和SRY基因片段，為雄性；3只僅擴增出ZFY/ZFX基因片段，沒有擴增出SRY基因片段，為雌性；其余未知性別的14只棕背鼠 平，鑒定為結果顯示7只為雄性，7只為雌性，與解剖結果一致(圖5)。PCR擴增結果顯示10只Wistar大鼠中5只為雄性，5只為雌性；8只BALB/c小鼠中5只為雌性，3只為雄性，與解剖結果一致，說明建立的雙重PCR擴增方法同樣適用于大鼠和小鼠的性別鑒定。

3 討論

對動物進行性別鑒定時，大多數PCR方法以動物的組織為實驗材料，對于一些性情兇猛、活動敏捷、不易抓取和固定的動物，獲取其組織材料比較困難。另外，從動物福利的角度出發，我們應盡量減少對動物的傷害。已有文獻證實以動物被毛為材料進行性別鑒定是完全可靠的，正確率100%[1]。本實驗以棕背鼠 平的被毛為實驗材料，利用Chelex-100提取毛囊中的DNA，并以提取的DNA作為PCR擴增的模板，該方法不僅不損害研究對象，采樣和DNA的提取也更加快捷，實驗結果準確可靠，還可以降低實驗成本。

注：M：DL 2000 DNA Marker；泳道1和35：陰性對照；泳道2～24：分別為棕背鼠 平樣品1～23；泳道25～34：分別為Wistar大鼠樣品1～10；泳道36～43：分別為BALB/c小鼠樣品1～8。圖4 棕背鼠 平、Wistar大鼠和BALB/c小鼠的性別鑒定Note. M: DL 2000 DNA Marker; Lane 1 and 35: Negative control; Lane 2-24: Samples 1-23 taken from grey red-backed voles, respectively; Lane 25-34: Samples 1-10 taken from Wistar rats, respectively; Lane 36-43: Samples 1-8 taken from BALB/c mice, respectively.Fig.4 Gender identification of the grey red-backed voles, Wistar rats and BALB/c mice

注：A：雌性；B：雄性。圖5 棕背鼠 平性別的解剖結果Note. A: Female; B: Male.Fig.5 Autopsy results demonstrating the gender identification of grey red-backed voles

與常規PCR方法(只針對雄性特異性基因進行一次擴增)不同，本實驗構建了ZFY/ZFX基因和SRY基因的雙重PCR擴增，以ZFY/ZFX基因作為PCR擴增的內參照，防止因PCR擴增SRY基因失敗造成假陰性，該方法提高了準確率，同時也增加了

模板的利用率。本實驗針對ZFY/ZFX基因和SRY基因建立的雙重PCR方法，能夠對棕背鼠 平的性別做出正確判斷，具有快速、準確、簡便等優點，可廣泛應用于野生動物研究領域以及實驗室繁育中的性別鑒定。該方法也可能存在一些局限性，對一些性別與正常情況不同，如Y染色體SRY基因缺失個體、染色體組型為XXY、XXX等個體，該方法不能做出正確鑒定，但這種情況在自然狀態下發生的幾率非常小[1]，可以忽略。通過利用針對ZFY/ZFX基因和SRY基因建立的雙重PCR擴增方法，可以對棕背鼠 平的性別做出正確判斷，合理安排分籠和繁殖，將對棕背鼠 平的實驗室繁育有重要影響。

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