殺線蟲海洋枝頂孢霉BH0531發酵條件的響應面優化

苗利華,張金源,李 娜,馮 欣,2,孟慶恒,2*,孫建華,2

(1.天津師范大學 生命科學學院,天津 300387；2.天津市動植物抗性重點實驗室,天津 300387)

植物寄生線蟲是重要的植物病原物之一,分布廣,種類多,廣泛寄生在農作物、蔬菜、果樹、林木、花卉及藥材上,給農林業生產帶來了巨大的經濟損失[1]。

目前,有關植物寄生線蟲的防治主要是化學殺線蟲劑,但是大部分存在高毒、高殘留、高污染等諸多缺點,使得化學殺線劑的應用受到一定程度的限制[2-4]。因此,防治效果好、對環境友好的生物源殺線劑受到了人們的重視[5],并且已在病原線蟲防治方面得到了廣泛的研究和應用[6]。海洋枝頂孢霉(Acremoniumsp.)BH0531是一株已經證實的對松材線蟲和根結線蟲均有較好殺線活性的菌株[7]；其發酵液對根結線蟲卵囊和分散卵的孵化以及J2幼蟲均具有明顯抑制作用,對J2幼蟲的殺線作用高于實驗條件下滅線磷及阿維菌素的測定值[8],因此,對該菌株進行殺線蟲活性的研究具有潛在的價值。在前期試驗中得出該菌株利用不同發酵培養基殺線效果不一,其中海水培養基生物量和殺線活性最高,馬鈴薯培養基次之,查氏培養基產量最低[9]。但在工業化生產中,土豆和海水培養基都不適合大規模發酵,存在操作繁瑣、腐蝕設備等缺點。而合成培養基不僅可以有效地避免這些問題且各營養成分明確,可以更方便準確地控制。因此,試驗選用察氏培養基為基礎發酵培養基,擬利用響應面分析法對其發酵培養基及工藝條件進行優化,從而提高發酵液的殺線效率,以期為菌株后續工業化放大研究提供可靠依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 供試菌株

海洋真菌枝頂孢霉(Acremoniumsp.)BH0531(菌種保藏號CGMCC-5445)、灰葡萄孢霉(Batrytis cinerea,BC)菌:天津師范大學生命科學學院微生物實驗室。

1.1.2 供試線蟲

松材線蟲(Bursaphelenchus xylophilus):天津師范大學生命科學學院微生物實驗室。

1.1.3 供試培養基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar,PDA)培養基:去皮馬鈴薯200 g/L煮汁,葡萄糖20 g/L,瓊脂15 g/L,MgSO40.05 g/L,pH自然,蒸餾水定容至1 000 mL,121℃、0.1 MPa滅菌20 min。

基礎發酵培養基:NaNO32 g/L,K2HPO41 g/L,MgSO40.5 g/L,KCl 0.5 g/L,FeSO40.01 g/L,葡萄糖20 g/L,pH值自然,121℃、0.1 MPa滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

SPX-250B-Z型生化培養箱:上海博訊實業有限公司醫療設備廠；DME/MVC2000型顯微鏡:德國徠卡公司；IS-RDV1立式單門雙層恒溫振蕩器:美國精騏有限公司；TOMY SX-500高壓滅菌鍋:日本TOMY Digital Biology公司；UEOS-503型中空纖維膜組件:天津膜天膜工程技術有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 發酵濾液的制備

取新的菌株斜面,加無菌水洗下孢子,制成1×106個/mL的孢子懸液,將孢子懸液以試驗設計中的接種量接入裝液量為50 mL/250 mL液體發酵培養基的三角瓶中。26℃、120 r/min振蕩培養。將發酵液除去菌體收集濾液,先經0.22 μm濾膜過濾,再經6 000 Da的超濾膜組件過濾,即為用于殺線蟲效果分析所需發酵液。

1.3.2 殺線蟲活性的測定

將收集到的線蟲配制成1 000條/mL的線蟲懸液。取96孔培養板,每孔板加入100 μL待測生物樣品和100 μL線蟲懸液(約100條),計數時向小孔內加入幾滴無菌水,統計線蟲死亡數,殺線率計算公式如下:

1.3.3 響應面試驗

(1)Plackett-Burman試驗[10]

表1 Plackett-Burman試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experiments

在單因素試驗基礎上,利用Plackett-Burman設計法對發酵培養基中的10個因素進行考察,每個因素取高低2個水平,高水平約為低水平的1.5倍[11]。Plackett-Burman試驗設計因素與水平見表1。

(2)最陡爬坡試驗

最陡爬坡試驗是通過對Plackett-Burman試驗設計的各因素結果進行分析,根據獲得的主要因子的效應值來確定爬坡路徑和步長,以快速逼近最佳區域[12]。

(3)Box-Behnten試驗

根據最陡爬坡試驗確定的試驗因素與水平,采用Box-Behnken設計原理和軟件分析,以主要影響因素為自變量,以殺線率為響應值設計響應面試驗,擬合自變量與響應值之間的函數關系[13]。

1.3.4 數據處理

應用Excel軟件進行試驗數據處理,利用Desigin-Expert version 8.0.6設計軟件進行響應面試驗設計及相關數據分析。

2 結果與分析

2.1 Plackett-Burman試驗篩選主要影響因子

根據單因子試驗結果,本試驗選用次數N=12的試驗設計,對蔗糖(A)、NaNO3(B)、蛋白胨(C)、K2HPO4(D)、MgSO4(E)、KCl(F)、FeSO4(G)、接種量(H)、初始pH(I)、發酵時間(J)、空項(K)等10個因素進行考察,每組試驗設計3次重復來測定發酵液的殺線率(Y)。試驗設計與結果見表2。借助Desigin-Expert version 8.0.6設計軟件進行數據分析,結果見表3。

表2 Plackett-Burman試驗設計與結果Table 2 Design and results of Plackett-Burman experiments

表3 Plackett-Burman試驗各因素效應分析Table 3 Effect analysis of each factor of Plackett-Burman experiments

2.2 最陡爬坡試驗選取中心點

由表3可知,各因素對殺線活性影響的大小順序為K2HPO4＞NaNO3＞培養時間＞接種量＞KCl＞FeSO4＞蔗糖＞MgSO4＞蛋白胨＞初始pH。其中影響最大的為K2HPO4、NaNO3、培養時間這3個因素,需進行最陡爬坡試驗優化分析,結果見表4。

表4 最陡爬坡試驗設計及結果Table 4 Design and results of steepest ascent experiments

由表4可知,各因素在第3組試驗附近取值時,發酵液殺線率最高,因此選取這一組試驗條件作為中心組合試驗的中心點,進行中心組合試驗設計。

2.3 Box-Behnken試驗確定最優組合

根據最陡爬坡試驗篩選出的試驗中心點,采用Box-Behnken試驗設計,利用Design-Expert version 8.0.6軟件進行3因素3水平的響應面分析試驗,其他因素取值為最陡爬坡試驗結果,共進行17次試驗,試驗因素與水平見表5,試驗設計及結果見表6,方差分析結果見表7。

表5 Box-Behnken試驗設計因素與水平Table 5 Factors and levels of Box-Behnken experiments design

表6 Box-Behnken試驗設計及結果Table 6 Design and results of Box-Behnken experiments

表7 回歸模型方差分析Table 7 Variance analysis of regression model

根據表6試驗結果,運用Desigin-Expert version 8.0.6設計軟件對數據進行多項式回歸擬合后得到的二次響應面的三元二次回歸方程為:

通過對模型進行顯著性檢驗分析,由表7可知,模型極顯著(P＜0.01),其中因素X2、X2X3、X12對發酵液的殺線率影響極顯著(P＜0.01),X1、X1X3、X32對殺線率的影響顯著(P＜0.05),失擬項P值為0.263 5,影響不顯著(P＞0.05),表明多元回歸方程具有顯著性,模型能較好的分析和預測響應值。模型決定系數R2為0.965 0,校正決定系數R2adj為0.920 1,表明模型能解釋96.50%的響應值的變化,模型可信度高。一般情況下,變異系數＜10%就可以說明模型具有良好的重復性[14]。經方差分析得到的變異系數為2.73＜10,表明模型準確度高,變異可能性低。信噪比(RSN)為17.543＞4,說明此模型具有較好的擬合度[15]。

利用Desigin-Expert version 8.0.6軟件,通過PB試驗以及Box-Behnken響應面二次回歸方差分析,得到可選擇的最優組合為NaNO33.4 g/L,K2HPO41.5 g/L,發酵時間130 h,其他條件為PB試驗得到的結果,即發酵條件為蔗糖25 g/L、蛋白胨1 g/L、MgSO40.4 g/L、KCl 0.6 g/L、FeSO40.025 g/L、接種量4%、初始pH 7、轉速120 r/min,溫度為26℃,裝液量為50mL/250mL時發酵液殺線活性最高。在此條件下發酵液的殺線率理論預測值為90.58%,與實際測定值88.00%相比,其相對誤差為2.58%,說明該模型能較好地模擬和預測試驗結果。

2.4 響應面因素交互作用分析

由圖1可知,對發酵液殺線活性影響比較大的因素為K2HPO4,其次為NaNO3,影響最小的為發酵時間,其中NaNO3和發酵時間、K2HPO4和發酵時間的交互作用對發酵液殺線活性影響顯著,這與表7的分析結果相吻合。

圖1 發酵時間、硝酸鈉和磷酸氫二鉀用量交互作用對殺線率影響的響應面及等高線Fig.1 Response surface plots and contour line of effects of interaction between fermentation time,NaNO3and K2HPO4addition on nematode mortality rate

3 結論

本試驗以松材線蟲為靶標線蟲,在單因子的基礎上,利用響應面法對海洋枝頂孢霉(Acremoniumsp.)BH0531產殺線活性物質的發酵條件進行了研究,結果得到優化后發酵液殺線率為88.00%,比方程預測值90.58%略低,而原始發酵條件下的殺線率為65.33%,說明優化后的發酵液殺線率活性比優化前提高了22.77%。但本研究是在實驗室搖瓶條件下進行,要實現工業化大規模開發生產,還需進一步培養工藝的研究。

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