葡糖醋桿菌利用黃水發酵生產細菌纖維素

李 周,賀富強,楊惠敏,文 章,胡 承

(四川大學 生命科學學院生物資源與生態環境教育部重點實驗室,四川 成都 610064)

黃水是濃香型固態白酒發酵過程中營養物質在微生物作用下形成的副產物,即糟醅淋漿與窖泥浸出物積淀到發酵池底,形成的黃色或者棕黃色具有特殊氣味的黏稠液體。黃水中含有大量可利用的營養物質,除含有醇、酸、醛、酯類等物質外,還含有部分糖類物質、含氮化合物和少量的單寧及色素等有機物。在以往的研究和生產中,黃水并未得到充分利用,且由于黃水的化學需氧量(chemical oxygen demand,COD)較高,通常可達25 000～40 000 mg/L,其豐富的有機質存在利用價值,若不充分利用則有造成環境污染的風險[1]。

細菌纖維素(bacterial cellulose,BC)是由木醋桿菌(Acetobacter xylinum)、葡糖醋桿菌(Gluconacetobacter)等微生物發酵而來的。BC的結構單位與植物纖維素相同,但BC具有高純度、高結晶度、高拉伸強度和較強的生物相容性等優良特性[2]。近年來,BC已經廣泛應用于食品、造紙、生物醫學材料、生物吸附材料等領域,是BC生產成本高、產量低等問題成為了其工業化大規模生產的瓶頸。如何利用較為廉價的資源來發酵產生更多的BC成為了目前研究的重點。

馬霞等[3]利用酒糟浸出液生產細菌纖維素,經優化后產量可提高140.6%,產量可達到14.44 g/L。陳慧慧等[4]利用楊木水解液生產BC,產量為3.14 g/L。KESHK S M[5]則發現在培養基中添加維生素C可以將BC的產量提高88%。ZENG X等[6]發現部分有機酸添加到HS培養基中可以顯著提高BC的產量。已有的研究表明[7],黃水中含有乙酸、檸檬酸等有利于BC生產的營養成分。本實驗為探究葡糖醋桿菌利用黃水發酵產BC的可行性,將黃水按照不同體積比添加到HS培養基中,再將葡糖醋桿菌接種至50 mL發酵液中30℃靜置培養7 d后,測定BC產量和還原糖含量、總酸含量、pH值等指標,從而得到最佳的黃水體積比,再進一步檢測最適黃水體積比下發酵過程中葡糖醋桿菌BC產量以及理化指標的變化趨勢。以期為葡糖醋桿菌利用黃水發酵生產BC提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡糖醋桿菌(Gluconacetobacter)G29:由本實驗室篩選和保藏；黃水:采樣于水井坊公司水井街基地窖池,4℃冰箱保存沉降,取上層液體。

葡萄糖、胰蛋白胨、酵母粉、檸檬酸、Na2HPO4·12H2O、瓊脂、氫氧化鈉、鹽酸(均為分析純):成都市科隆化學品有限公司。

對羥基苯甲酸酰肼(4-hydroxybenzoic acid hydrazide,PAHBAH)[8]:

A:0.5 mol/L HCl溶解的5%對羥基苯甲酸酰肼溶液,配好后4℃冰箱保存。

B:0.5 mol/L NaOH溶液

使用時將A與B按1∶9體積比混合即為對羥基苯甲酸酰肼試劑。

HS培養基:葡萄糖20 g/L,蛋白胨5 g/L,酵母粉5 g/L,檸檬酸1 g/L,Na2HPO45 g/L[9],pH值調為5.8,115℃滅菌30 min[9]。

1.2 儀器與設備

SQPPRACTUM224-1CN電子天平:賽多利斯科學儀器；PHS-2C筆式pH計:上海康儀儀器有限公司；101型電熱鼓風干燥箱、HWS-150恒溫恒濕培養箱:北京中興偉業儀器有限公司；UV-2450紫外可見分光光度計:日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 不同黃水體積比對BC產量及發酵液理化性質的影響

將黃水添加到HS培養基中,配制50 mL黃水-HS培養基,且使最終黃水所占體積比分別為:10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%,裝入250 mL錐形瓶中,pH值調節為5.8,115℃滅菌30 min。以HS培養基為對照,按照10%的接種量將經過3次傳代的葡糖醋桿菌G29分別接種到黃水-HS培養基,30℃靜置培養7 d,測定發酵液的總酸含量、還原糖消耗量、糖轉化效率、pH值和BC產量[10]。

1.3.2 發酵過程中BC產量以及理化指標的變化

選擇1.3.1節中BC產量最高時的黃水體積比,配制50mL培養基,裝入250 mL錐形瓶中。按照10%的接種量將葡糖醋桿菌G29接種到黃水-HS培養基中,以HS培養基作對照,30℃靜置培養7 d,每隔1 d進行取樣,測定其總酸含量、還原糖消耗量、糖轉化效率、pH值和BC產量。

1.3.3 擴大淺圓盤發酵對BC產量以及糖轉化效率的影響

選擇1.3.1節中BC產量最高時的黃水體積比,配制成500mL黃水-HS培養基,置于特制淺圓盤(直徑295mm)中,以HS培養基作對照,按照10%的接種量將葡糖醋桿菌G29接種到黃水-HS培養基中,30℃靜置培養7 d,測定其糖轉化效率和其BC產量。

1.3.4 分析方法

還原糖含量的測定[8]:采用對羥基苯甲酸酰肼(PAHBAH)試劑法。還原糖消耗量的計算公式如下:

還原糖消耗量=發酵前還原糖含量(g/L)-發酵后還原糖量(g/L)

單日還原糖消耗量N=還原糖含量N-1(g/L)-還原糖含量N(g/L)(N代表第N天,下同)

BC產量的測定[11]:將生成的BC膜用自來水多次沖洗浸泡除去其表面的雜質,至顏色較淡,再將膜置于80℃氫氧化鈉(1 mol/L)溶液中浸泡90 min,然后置于80℃蒸餾水中洗滌至中性,洗滌過程重復兩次,于烘箱中75℃烘干至恒質量,稱質量。BC產量計算公式如下:

總酸含量(以乙酸計)的測定參考GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》中的方法；pH值的測定參考GB 5009.237—2016《食品安全國家標準食品pH值的測定》中的方法；乙醇含量的測定參考GB 5009.225—2016《食品安全國家標準酒中乙醇濃度的測定》中的方法。

1.3.5 數據處理

數據統計采用SPSS22.0單因素方差分析(P＜0.05),實驗結果表示為平均數±標準差,圖表分析由Excel2007完成。

2 結果與分析

2.1 黃水的成分分析

將黃水靜置后取上層液體,檢測其總酸含量、pH值、還原糖含量、乙醇含量,結果見表1。

表1 黃水的理化指標檢測結果Table 1 Detection results of physical and chemical indexes of"yellow water"

由表1可知,黃水中含有8.2 g/L的還原糖、4.73 g/L的總酸含量以及2.6%的乙醇。這些成分可以作為混合碳源被葡糖醋桿菌利用,而HS培養基組分中只有葡萄糖作為主要碳源,陳華美等[12]研究結果表明,多種混合碳源更有有利于菌株發酵。且黃水中含有的乙酸、乙醇等物質已被張麗平等[13]研究證明有利于葡糖醋桿菌產生BC。因此,黃水具有發酵生產細菌纖維素的價值。

2.2 不同黃水體積比對BC產量以及發酵液理化性質的影響

不同黃水體積比對葡糖醋桿菌的BC產量和發酵液中還原糖消耗量的影響如圖1所示。由圖1可知,隨著黃水體積比的增加BC產量呈先增后減的趨勢,當黃水體積比為40%時,BC產量最高,可達5.93 g/L,比對照組的BC產量(2.20 g/L)提高了169.5%；繼續增加黃水體積比,發酵液中BC產量開始減少；當黃水體積比分別為90%和100%時,混合培養基中基本不產生BC,原因可能是黃水雖然含有乙醇、乙酸等有利于葡糖醋桿菌產生BC的物質,但同樣也含有少量有毒物質如糠醛等[14],抑制葡糖醋桿菌生長,此外黃水中還原糖含量較少,也可能是當黃水體積比過高時制約BC產生的原因之一。當黃水體積比＜50%時,還原糖消耗量均維持在10 g/L左右,比對照組略有提高；當黃水體積比＞50%時,還原糖消耗量減少至8 g/L左右,當黃水體積比至90%及以上時,還原糖消耗量接近零。結果表明,添加適量的黃水到HS培養基中能夠提高BC產量。

圖1 黃水體積比對細菌纖維素產量和還原糖消耗量的影響Fig.1 Effect of volume ratio of"yellow water"on bacterial cellulose yield and reducing sugar consumption

檢測不同黃水體積比的黃水-HS培養基發酵結束后發酵液的pH值、總酸含量以及糖轉化效率,結果如表2所示。由表2可知,黃水-HS培養基發酵液的pH值在4.73～5.58之間,相比于對照組的pH值(3.38),有顯著的提高(P＜0.05),由于葡糖醋桿菌最適發酵pH值為4.0～6.0[5],因此黃水-HS培養基發酵液的pH更有利于BC的產生。總酸含量當黃水體積＞70%時有顯著提高(P＜0.05)；同時黃水的添加可以顯著提高葡糖醋桿菌的糖轉化效率(P＜0.05),當黃水體積比為40%時,糖轉化效率達到最大為57.86%,相比對照組(23.25%)提高了148.9%,這可能是因為葡萄糖作為碳源時會產生副產物葡萄糖酸,降低培養基的pH[15],而黃水中的還原糖、有機酸、乙醇豐富了碳源,減少了葡萄糖酸的產生,這樣不僅可以維持pH的穩定,也可以促使培養基中的葡萄糖更多地轉化為BC生物合成的基質,進而提高糖轉化率[16],糖轉化效率高表明葡糖醋桿菌可以消耗相同的還原糖產生更多的BC。結果表明,黃水的添加可以使發酵液的pH維持在4.61～5.58之間,有利于BC的產生,同時能提高糖轉化效率。當黃水體積比為40%時,葡糖醋桿菌的BC產量和糖轉化效率均為最高,因此選擇最佳黃水體積比為40%。

表2 不同黃水-HS培養基發酵結束后pH、總酸含量以及糖轉化效率的比較Table 2 Comparison of pH,total acid content and sugar conversion rate after fermentation of different"yellow water"-HS medium

2.3 發酵過程中BC產量以及理化指標變化

圖2 發酵過程中單日還原糖消耗量和細菌纖維素的產量Fig.2 Daily reducing sugar consumption and bacterial cellulose yield during fermentation

將葡糖醋桿菌分別接種于40%黃水-HS培養基和HS培養基進行培養,每天取樣測定其單日還原糖消耗量和BC產量,結果如圖2所示。由圖2可知,40%黃水-HS培養基的單日BC產量呈先增后減的趨勢,且除第1天的BC產量較低外,從第2天起均保持較高水平(＞0.7 g/L),HS培養基的單日BC產量也呈先增加后減少的趨勢,但前兩天產細菌纖維素較少,第3天開始BC產量增加,且僅有第4天的BC產量較高(1.11 g/L),其余天數較低(＜0.6 g/L),說明40%黃水-HS培養基中的葡糖醋桿菌能更快地產生次級代謝產物BC,且能長時間的保持較高的BC產量,這可能是因為黃水含有豐富的營養成分,促進葡糖醋桿菌的快速繁殖,使培養基中的BC產量快速達到一個較高的水平；同時整個發酵過程中40%黃水-HS培養基的單日還原糖消耗量均在1.4g/L左右,而HS培養基中的單日還原糖消耗量波動較大,最大值為2.96 g/L,最小值為0.4 g/L,說明40%黃水-HS培養基中的葡糖醋桿菌代謝較為穩定。

表3 40%黃水-HS培養基單日pH、總酸含量以及糖轉化效率的變化Table 3 Changes of daily pH,total acid content and sugar conversion rate of 40%"yellow water"-HS medium

表4 HS培養基單日pH、總酸含量以及糖轉化效率的變化Table 4 Changes of daily pH,total acid content and sugar conversion rate of HS medium

由表3和表4可知,在整個發酵過程中,40%黃水-HS培養基的pH值呈先減后增的趨勢,且維持在4.60～5.50之間,僅在第2天、第4天比初始pH值有顯著降低(P＜0.05),HS培養基的pH值則不斷降低,從第2天起均顯著低于未發酵培養基(P＜0.05),最后降為3.75,說明40%黃水-HS培養基的pH值更加穩定；40%黃水-HS培養基的總酸含量從第2天開始相比于初始值有顯著增加(P＜0.05),最高可達0.480 g/L,但發酵結束時又回到初始值,而HS培養基的總酸含量從第3天起,均為0.200 g/L左右,顯著高于未發酵培養基(P＜0.05)；40%黃水-HS培養基和HS培養基的單日糖轉化效率均呈先增后減的趨勢,但40%黃水-HS培養基單日糖轉化效率均比同天數HS培養基高。這可能是因為雖然在BC的合成過程中葡萄糖酸等酸性物質會不斷積累,但黃水中的有機酸在培養基初始pH值的調整過程中會由于氫氧化鈉的添加而產生大量的弱酸鹽,能夠起到一定的緩沖作用；葡萄糖合成的多聚物是合成纖維素的主要原料,而黃水中的糖類物質也可以作為葡糖醋桿菌的能源物質,這樣更多的葡萄糖可以用來合成纖維素,糖轉化效率也就提高了[17]。綜合發酵過程中BC產量、pH和糖轉化效率來看,40%黃水-HS培養基要優于HS培養基,其黃水組分起到了良好的緩沖作用。

2.4 擴大淺圓盤發酵對BC產量以及糖轉化效率的影響

由表5可知,擴大淺圓盤發酵的40%黃水-HS培養基中BC產量為3.48 g/L,較對照組(1.62 g/L)提高了114.8%,較錐形瓶發酵(5.93 g/L)降低了41.4%；糖轉化效率為22.70%,較對照組(8.10%)提高了180.2%,較錐形瓶發酵(22.7%)降低了60.8%。說明發酵體系的擴大后,40%黃水-HS培養基的BC產量和糖轉化效率仍顯著優于對照組(P＜0.05),但相比于錐形瓶發酵時,葡糖醋桿菌的BC產量和糖轉化效率有所降低。原因可能是與錐形瓶發酵相比,擴大淺圓盤發酵中表面積/發酵空間增大,液面上空間減少,氧氣總量降低,導致葡糖醋桿菌供氧不足,BC產量下降,這與KUO C H等[18]的研究結果一致。結果表明,40%黃水-HS培養基在擴大發酵中仍優于HS培養基。

表5 擴大淺圓盤發酵細菌纖維素產量和糖轉化效率Table 5 Bacterial cellulose yield and sugar conversion rate during expanded shallow disk fermentation

3 結論

將黃水以不同體積比添加到HS培養基中進行葡糖醋桿菌發酵生產BC,測定發酵7 d后發酵液中BC產量和還原糖消耗量等指標。結果表明,黃水最佳體積比為40%,在此條件下,BC產量為5.93g/L,相比對照組(HS培養基)提高了169.5%；糖轉化效率為57.86%,相比對照組提高了148.9%。進一步檢測發酵過程中葡糖醋桿菌BC產量以及理化指標變化,40%黃水-HS培養基單日BC產量均保持較高水平,最大值為1.14 g/L；單日糖轉化效率均高于同時期的對照組；pH值維持在4.60～5.50之間。在擴大淺圓盤發酵中,40%黃水-HS培養基中BC產量為3.48 g/L,糖轉化效率為22.70%,與對照組相比,也均有顯著提高(P＜0.05)。黃水作為HS培養基的補充不僅提高了BC產量,也為開發利用黃水這一白酒工業副產物提供了新的途徑。

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