費氏丙酸桿菌生物學特性及與5株益生菌拮抗性試驗研究

陳桂芳,劉 艷,,單春喬,馮柳柳,宋 凡,江國托,*

(1.江蘇三儀生物工程有限公司,江蘇 邳州 221300；2.大連三儀動物藥品有限公司,遼寧 大連 116036)

丙酸桿菌屬(Propionibacteriumspp.,PB)是厭氧或耐氧的革蘭氏陽性菌,不運動,不產生芽孢,在溫度為30～37℃、pH接近7的環境中繁殖速度最快[1]。研究表明,丙酸桿菌能夠促進雙歧桿菌生長；產生細菌素等物質抑制致病菌的繁殖；利用乳酸產生丙酸,而丙酸作為前體物質可以通過糖異生作用生成葡萄糖,為機體提供能量[2-4]。費氏丙酸桿菌(Propionibacterium freudenreichii,PF)是丙酸桿菌的一種,屬于食品級微生物,我國于2010年將其列入《可用于食品的菌種名單》中[5]。ANGELOPOULOU A等[6]首次將費氏丙酸桿菌作為益生菌加入白紋奶酪中制成了益生羊乳酪,同時發酵產生的丙酸和乙酸也能夠促使結腸癌細胞的凋亡。RYZHKOVA E P等[7]研究發現,費氏丙酸桿菌能夠產生抑制細菌和真菌的多肽類物質,用于食品的保鮮。杜葳等[8]研究了一種費氏丙酸桿菌細胞離位轉化生產維生素B12的方法,使維生素B12的產量達到108.06 mg/L。ABURJAILE F F等[9]研究發現,費氏丙酸桿菌通過降低氧化磷酸化作用、糖酵解和Wood-Werkman循環等調節營養不良患者的新陳代謝活動。目前國內外對費氏丙酸桿菌的研究主要集中在食品酸奶發酵劑和其對人類的益生作用方面,對其生物學特性和與別的益生菌間的拮抗作用的研究鮮有報道。

為了評價費氏丙酸桿菌的益生菌特性,本研究以費氏丙酸桿菌為對象,采用平板計數法研究其抑菌性、耐酸性、耐膽鹽和耐高溫等生物學特性,并通過平板劃線法研究其與別的益生菌間的拮抗作用,以期為該菌的應用提供理論依據,并為其工業化生產奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

費氏丙酸桿菌(Propionibacterium freudenreichii)、糞腸球菌(Enterococcus faecalis)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、丁酸梭菌(Clostridium butyricum)、凝結芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)、大腸桿菌(Escherichia coli)、沙門氏菌(Salmonella)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus):江蘇三儀生命科學研究院分離并保藏。

1.1.2 培養基及試劑

水或乳糖肉湯(saline lactose broth,SLB)培養基:胰蛋白胨1%,酵母粉1%,葡萄糖2%,K2HPO40.025%,MnSO4·H2O 0.005%；營養瓊脂培養基:紹興天恒生物科技有限公司；MRS培養基:葡萄糖2%,蛋白胨1%,酵母粉1%,牛肉膏0.5%,K2HPO40.2%,檸檬酸銨0.2%,無水乙酸鈉0.5%,MgSO4·7H2O 0.058%,MnSO4·H2O 0.025%,吐溫-80 0.1%；丁酸梭菌專用培養基:根據參考文獻[10]配制；以上培養基添加1.5%瓊脂粉即為其固體計數培養基。膽鹽:北京索萊寶科技有限公司；鹽酸、氫氧化鈉(分析純):國藥集團化學試劑有限公司；革蘭氏染液試劑盒:南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設備

YQX-1型厭氧培養箱:上海躍進醫療器械有限公司；HPX-9272數顯電熱培養箱:上海博迅實業有限公司醫療設備廠；SW-CJ-2F型雙人雙面凈化工作臺:上海滬粵明科學儀器有限公司；TGL-16B高速臺式離心機:上海安亭科學儀器廠；GI54DWS立式高壓滅菌鍋:致微(廈門)儀器有限公司；Nikon E100生物顯微鏡:上海尼康儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 費氏丙酸桿菌的性狀

取適量費氏丙酸桿菌菌粉溶解于無菌SLB液體培養基中,37℃厭氧靜置培養48 h,劃線,37℃厭氧恒溫箱中培養72 h,觀察其菌落形態并進行革蘭氏染色。

1.3.2 體外混合培養對病原菌的抑制作用

[11-12],取培養好的大腸桿菌和費氏丙酸桿菌菌液接入SLB液體培養基中,使大腸桿菌和費氏丙酸桿菌的初始活菌數相同,37℃靜置培養,于接種培養0、12 h、24 h、36 h和48 h時分別取樣,對費氏丙酸桿菌和大腸桿菌進行菌落計數,并設單獨培養為對照。沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的測定方法同上。

1.3.3 耐酸性試驗

將培養48h的費氏丙酸桿菌菌液按1%的接種量轉接到5 mL新鮮SLB液體培養基中,37℃靜置培養至OD600nm=1.0,離心收集菌體,棄掉培養基。將菌體懸浮在pH值為2.0、2.5、3.0的SLB液體培養基中,37℃繼續培養0、1 h、2 h和3 h后,等比稀釋,涂布SLB平板,活菌計數,每個試驗重復3次,求其平均值。

1.3.4 耐膽鹽試驗

方法同耐酸性試驗,不同之處在于,將菌體懸浮在牛膽鹽含量為0.03%、0.10%、0.20%、0.30%的SLB液體培養基中,37℃繼續培養0、2 h、4 h和6 h后,進行活菌計數。

1.3.5 耐高溫試驗

參考陳新亮等[13]的方法,并作相應修改。取培養48 h的菌株分別于45℃、50℃、55℃、60℃水浴中處理20 min,以不作高溫處理的菌株作為對照組。進行平板計數,計算菌株存活率,其計算公式如下:

1.3.6 與其他益生菌拮抗性試驗

參考范利霞[14]的方法進行拮抗性試驗,對費氏丙酸桿菌、枯草芽孢桿菌、糞腸球菌、丁酸梭菌和凝結芽孢桿菌分別進行編號1、2、3、4、5,其中費氏丙酸桿菌用SLB培養基；糞腸球菌和凝結芽孢桿菌用MRS瓊脂平板；枯草芽孢桿菌用營養瓊脂平板；丁酸梭菌用專用培養基。

1.3.7 數據分析

采用Origin8.0繪圖,SPSS19.0統計軟件進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 費氏丙酸桿菌的性狀

由圖1A可知,費氏丙酸桿菌是革蘭氏陽性菌,短桿狀,菌落0.2～0.5 mm,圓形,凸面到墊狀,半不透明,閃光,淡黃色。由圖1B可知,在顯微鏡下,費氏丙酸桿菌呈短桿狀,細胞單個、成對或短鏈,呈“V”或“Y”字形出現,這與《伯杰氏系統細菌學手冊》的描述相一致。

圖1 費氏丙酸桿菌的菌落形態(A)和細胞形態(B)Fig.1 Colonial(A)and cell(B)morphology ofP.freudenreichii

2.2 抑菌作用

大多數益生菌對致病菌具有較好的抑制作用。費氏丙酸桿菌(PF)對致病菌的抑制作用結果如圖2所示。由圖2A可知,當與大腸桿菌共培養時,費氏丙酸桿菌隨著培養時間的延長呈對數生長,其活菌數對數與對照組沒有差異性(P＞0.05)；實驗組大腸桿菌在36 h和48 h活菌數略有降低,但均未達到1個數量級,可見其對大腸桿菌的抑制作用不明顯(P＞0.05)；由圖2B可知,當與沙門氏菌共培養時,費氏丙酸桿菌隨著培養時間的延長呈對數生長,其活菌數對數與對照組沒有差異性(P＞0.05)；實驗組沙門氏菌在12 h和24 h活菌數對數比對照組略有降低,但是36 h和48 h又與對照組相同,因此和大腸桿菌相似,費氏丙酸桿菌對沙門氏菌也沒有明顯的抑制作用；由圖2C可知,當與金黃色葡萄球菌共培養時,費氏丙酸桿菌的活菌數對數與對照組差異不顯著(P＞0.05)；從24h開始,實驗組金黃色葡萄球菌活菌數對數明顯低于對照組(P＜0.01),且差異性逐漸增大,在48 h時活菌數差異性最大(P＜0.01),達2個數量級,可見費氏丙酸桿菌對金黃色葡萄球菌具有明顯的抑制作用。

圖2 費氏丙酸桿菌對大腸桿菌(A)、沙門氏菌(B)和金黃色葡萄球菌(C)的抑制作用Fig.2 Results of inhibiting the growth ofEscherichia coil(A),Salmonella(B)andStaphylococcus aureus(C)

2.3 耐酸性試驗

益生菌要在胃腸道中保持一定的存活數量,耐酸性是一個重要特性。動物和人胃液的pH值在3.0左右,而食物在胃中消化的時間一般為1～2 h[15-16]。對費氏丙酸桿菌的耐酸性進行了評價,結果如圖3所示。由圖3可知,隨著pH值下降和時間上升,費氏丙酸桿菌活菌數呈現下降的趨勢,在pH值為2.0的環境中培養3h,活菌數降到最低為7.01lg(CFU/mL),活菌數只下降了一個數量級,說明費氏丙酸桿菌具有很好的酸耐受性。另外,無論pH為2.0、2.5還是3.0,活菌數在1h內從8.37 lg(CFU/mL)分別降低至7.66、7.72和7.90 lg(CFU/mL),之后的2～3 h仍維持在7.00 lg(CFU/mL),說明費氏丙酸桿菌抗逆性強,對酸性環境表現出較強的適應能力。費氏丙酸桿菌的耐酸性能力類似于乳酸菌,其較強的耐酸能力是在腸道定植生長的關鍵要素。CAMPANIELLO D等[17]研究發現,費氏丙酸桿菌能夠耐受pH=2.5的胃環境,并在胃腸道中的定植發揮益生作用,和本研究結果相似。

圖3 費氏丙酸桿菌的耐酸性試驗結果Fig.3 Results of acid tolerance tests ofP.freudenreichii

2.4 耐膽鹽試驗

益生菌對膽鹽的耐受能力是決定其能否在腸道存活、定植并發揮功效的首要條件之一。菌株本身的特性和膽鹽的濃度是影響其耐受能力的主要因素。腸道中膽鹽的質量分數在0.03%～0.30%范圍內波動[16],因此,通過研究益生菌株在不同濃度膽鹽中的生長情況,可以評價該菌株的耐膽鹽能力[18-19]。對費氏丙酸桿菌的膽鹽耐受特性的研究,結果如圖4所示。

圖4 費氏丙酸桿菌的耐膽鹽試驗結果Fig.4 Results of bile salt tolerance tests ofP.freudenreichii

由圖4可知,費氏丙酸桿菌在各膽鹽含量中培養6 h,活菌數都保持在原來的數量級,可見費氏丙酸桿菌具有較強的膽鹽耐受活性,可以順利通過小腸。在膽鹽含量為0.03%的環境中,菌株對膽鹽的耐受性最強,在該膽鹽含量環境中培養6h菌株存活率為36.47%。而在0.10%、0.20%和0.30%的膽鹽含量壞境中,培養6h后存活率分別為32.09%、23.97%和18.67%。

2.5 耐高溫試驗

益生菌制劑是活菌制劑,對溫度、壓力、pH值等外界環境較敏感,這將促使在飼料制粒過程的高溫高壓條件下其活性受到一定的損失,嚴重影響使用效果[20]。因此耐高溫活性強的益生菌能夠提高在飼料加工過程中存活率。溫度對費氏丙酸桿菌的影響結果如表1所示。由表1可知,45℃處理20 min,存活率為53.6%；溫度上升至55℃時,費氏丙酸桿菌活菌數下降達到一個數量級,存活率變為30.6%；溫度繼續上升為60℃時,存活率下降至12%,這說明費氏丙酸桿菌對溫度有一定的耐受能力,但耐受力低于芽孢桿菌和一些乳酸菌[21],該結果為費氏丙酸桿菌后期的包被材料和干燥方式的選擇提供了參考依據。

表1 費氏丙酸桿菌的耐高溫試驗結果Table 1 Results of high-temperature tolerance tests ofP.freudenreichii

2.6 與其他益生菌拮抗性試驗

考慮到不同菌株在不同培養基中生長情況不同,選擇分別研究每種菌株在其最適培養基上與其他4株菌的拮抗作用,然后分析菌株之間的作用效果。5株益生菌間的拮抗性試驗,結果如圖5所示。由圖5A可知,費氏丙酸桿菌與其他4株菌劃線相交處菌落連續,表明費氏丙酸桿菌與其他4株菌無拮抗作用,可見費氏丙酸桿菌可以與常用益生菌配伍使用,從而更大程度的發揮益生菌間的復合益生效果；由圖5B可知,枯草芽孢桿菌與其他3株菌劃線相交處菌落連續,與丁酸梭菌劃線相交處菌落不連續,表明枯草芽孢桿菌與費氏丙酸桿菌、糞腸球菌和凝結芽孢桿菌無拮抗作用,與丁酸梭菌有拮抗作用；由圖5C可知,糞腸球菌與其他4株菌劃線相交處菌落連續,表明糞腸球菌與其他4株菌無拮抗作用；由圖5D可知,丁酸梭菌同其他3株菌劃線相交處菌落連續,與枯草芽孢桿菌劃線相交處不連續,表明丁酸梭菌與費氏丙酸桿菌、糞腸球菌和凝結芽孢桿菌無拮抗作用,與枯草芽孢桿菌有拮抗作用；由圖5E可知,凝結芽孢桿菌與其他4株菌劃線相交處菌落連續,表明凝結芽孢桿菌與其他4株菌無拮抗作用。因此,在益生菌復配過程中,應考慮到丁酸梭菌和枯草芽孢桿菌間的拮抗作用提高復合微生態制劑的益生活性；而其余菌株間沒有拮抗作用,可進行配伍獲得更強益生效果的復合益生菌劑。

圖5 益生菌間的拮抗性試驗結果Fig.5 Results of antagonism tests between probiotics

2.7討論

2.7.1 益生菌耐受性

影響益生菌在腸道內定植的主要因素為低酸度和膽汁酸鹽的濃度[22-23]:動物和人類胃液pH值通常在3左右,具有很強的殺菌作用,因而具有耐酸能力的益生菌才能在消化道內生長繁殖并發揮作用；而膽汁酸鹽通過分解細菌細胞壁中的脂肪,使細菌失活,耐膽鹽能力越強的益生菌,其在腸道內的存活幾率越大,因此人們需要全面考慮菌株的生物學特性才能篩選出性狀良好的益生菌種[12,24-25]。本試驗結果表明費氏丙酸桿菌具有一定的耐酸和耐高溫特性以及較強的膽鹽耐受能力。歐洲食品組織認定費氏丙酸桿菌是不具有耐藥性和毒力因子的安全性菌株[3],因此費氏丙酸桿菌可以作為益生菌添加到人類膳食中。結果還表明費氏丙酸桿菌對金黃色葡萄球菌具有很好的抑制作用,但是具有抑菌作用的產物類型尚不完全清楚,抑菌機制亦有待深入研究。

2.7.2 益生菌間拮抗性試驗

生物拮抗作用是生物之間的競爭性排斥、干擾和抑制等作用[26]。益生菌的生物拮抗作用有兩方面的表現:益生菌與致病菌以及益生菌與益生菌的拮抗作用。研究益生菌間的生物拮抗作用是制備復合微生態制劑的前提。丁酸梭菌與枯草芽孢桿菌間有拮抗作用,這說明這兩種益生菌不適合配伍制備復合微生態制劑。費氏丙酸桿菌與糞腸球菌、枯草芽孢桿菌、丁酸梭菌和凝結芽孢桿菌均沒有拮抗作用,可以復配使用,這為費氏丙酸桿菌的工業化應用提供了新方向。當然,對于費氏丙酸桿菌具體的益生效果需要通過臨床試驗進一步來驗證。

3 結論

費氏丙酸桿菌在體外共培養時,對金黃色葡萄球菌具有顯著的抑制作用(P＜0.01),且具有一定的耐酸性和很強的耐膽鹽活性,在膽鹽含量為0.3%的條件下培養6 h存活率達18.67%。費氏丙酸桿菌對高溫能力耐受能力較弱,在60℃條件下維持20 min,存活率下降為12.0%。拮抗性實驗結果表明,費氏丙酸桿菌與枯草芽孢桿菌、糞腸球菌、凝結芽孢桿菌和丁酸梭菌均沒有拮抗作用。因此,費氏丙酸桿菌作為具有益生特性的食品微生物,可以作為微生態制劑單獨或者與其他益生菌配伍,應用在動物和人類健康中。

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