高生物量富硒產朊假絲酵母培養(yǎng)基優(yōu)化

李俊杰,管軼男,管 斌*,孔 青

(1.中國海洋大學 食品科學與工程學院,山東 青島 266003；2.青島蔚藍生物股份有限公司,山東 青島 266101)

硒是人體必需的微量元素之一,對機體至關重要。其保護機體免受自由基的損傷,參與重金屬解毒,調控機體免疫系統(tǒng)[1],是生物體內谷胱甘肽過氧化物酶、硫氧還蛋白還原酶、碘化甲腺原氨酸脫碘酶等多種蛋白的重要組成部分[2]。機體可以攝入無機硒和有機硒進行補硒,其中有機硒化合物生物利用率高,毒性較小。酵母在培養(yǎng)過程中可以通過自身的代謝活動,將無機硒與體內大分子結合轉化為有機形式,主要以硒代氨基酸和含硒蛋白形式存在[3]。富硒酵母由于富含蛋白質和B族維生素、食用安全性強以及生物利用率高等優(yōu)點而成為缺硒人群的膳食補充劑[4]。酵母對硒的富集受菌種、培養(yǎng)基的成分及硒濃度的影響[2]。目前常用的富硒酵母菌株有:釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和產朊假絲酵母(Candida utilis)[4-6]。C.utilis可以在胞內大量積累谷胱甘肽(glutathione,GSH),作為美國食品藥品監(jiān)督管理局評價食品添加劑安全性指標(generally regarded as safe,GRAS)微生物,應用前景廣闊[7]。高生物量是酵母富硒研究的基礎,但目前,常用的培養(yǎng)基加硒后酵母生長會受到明顯的抑制,不利于無機硒的生物轉化。常見培養(yǎng)基的優(yōu)化多集中在釀酒酵母上,對C.utilis培養(yǎng)基優(yōu)化的研究較少[8-9]。因此本試驗從富含GSH的C.utilis菌株出發(fā),運用Plackett-Burman設計和響應面法對培養(yǎng)基組成進行優(yōu)化,以期為提高菌株性能,實現(xiàn)工業(yè)化生產奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

產朊假絲酵母(Candida utilis)2.0281:中科院微生物保藏中心,按照參考文獻[10]的方法高效選育得到菌株U-16。

1.1.2 試劑

葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、變色酸、鹽酸苯肼、氯酸鉀(分析純或生化試試):國藥集團化學試劑有限公司；谷胱甘肽標準品(≥98%):美國Sigma公司；庚烷磺酸鈉、甲醇(均為色譜純):百靈威科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基(yeast extract peptone dextrose,YPD)(種子培養(yǎng)基):葡萄糖2%,蛋白胨2%,酵母粉1%。斜面培養(yǎng)基:在種子培養(yǎng)基中加入2%瓊脂。

酵母浸出粉胨蔗糖(yeast extract peptone sucrose,YPS)培養(yǎng)基:蔗糖5%,蛋白胨2%,酵母粉1%。

普通培養(yǎng)基:按照參考文獻[11]配制。

G培養(yǎng)基:按照參考文獻[12]配制。

G改良培養(yǎng)基:葡萄糖30 g/L,蛋白胨10 g/L,(NH4)2SO46 g/L,KH2PO43 g/L,肌醇 3 mg/L,MgSO42.4 g/L,FeSO4·7H2O0.01g/L,ZnSO4·7H2O0.12g/L,MnSO4·6H2O 0.024g/L,CuSO4·5H2O0.006g/L,維生素B61.2mg/L,生物素0.06mg/L。

S培養(yǎng)基:按照參考文獻[9]配制。

以上培養(yǎng)基pH均為6.0,發(fā)酵12 h加入亞硒酸鈉(濾膜過濾除菌)[11]。

1.2 儀器與設備

Agilent 1100高效液相色譜儀(high performance liquid chromatography,HPLC):上海荊和分析儀器有限公司；TGL-16C離心機:上海安亭科學儀器廠；722N型可見分光光度計:上海精科電子有限公司；HZQ-X100型振蕩培養(yǎng)箱:東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司；ZDX-35BI型高壓蒸汽滅菌鍋:上海申安醫(yī)療器械廠。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)方法

種子培養(yǎng):接種一環(huán)菌株U-16至種子培養(yǎng)基中,于28℃、200 r/min培養(yǎng)20 h。

發(fā)酵培養(yǎng):接入10%的種子液(出芽率＞20%,死亡率＜1%,細胞數(shù)＞106個/mL),30 ℃、200 r/min培養(yǎng)48 h[10]。

菌株保藏:4℃斜面保藏。

1.3.2 不同發(fā)酵培養(yǎng)基對產朊假絲酵母性能的影響

將種子液接種于上述6種不同的發(fā)酵培養(yǎng)基,發(fā)酵12 h加入25 μg/mL亞硒酸鈉[13],培養(yǎng)48 h,測定酵母的生物量、有機硒和GSH含量。

1.3.3 發(fā)酵培養(yǎng)基響應面優(yōu)化

釆用PB設計法對G改良發(fā)酵培養(yǎng)基的12個因子進行篩選,選取G改良培養(yǎng)基中的各因子含量為0水平,試驗設計及數(shù)據(jù)分析采用Design-expert8.0軟件,每組設計共3組重復試驗,結果取平均值。12個考察因素及其編碼水平見表1。

由PB篩選試驗確定影響富硒酵母生長的關鍵因子,之后考慮各因素效應大小,確定下一步試驗水平的中心點及各個水平參數(shù)。

表1 響應面優(yōu)化試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments

1.3.4 亞硒酸鈉添加量對酵母生長的影響

培養(yǎng)基中硒含量過高,會對酵母生長產生抑制[4、11、14]。為確定酵母生長的最適硒添加量,在培養(yǎng)基優(yōu)化的基礎上,進一步探究了亞硒酸鈉添加量(15 μg/mL、20 μg/mL、25 μg/mL、30 μg/mL、35 μg/mL、40 μg/mL)對酵母生長的影響。

1.3.5 測定方法

菌體干質量(dry cell mass,DCM):菌液6 000 r/min離心5 min,洗滌菌體,烘干至質量恒定。

GSH測定:采用高效液相色譜法[15]。

胞內有機硒檢測方法:胞內總硒和胞內無機硒的測定方法參照文獻[11]。胞內有機硒=胞內總硒-胞內無機硒。

2 結果與分析

2.1 不同發(fā)酵培養(yǎng)基對富硒產朊假絲酵母生物量的影響

表2 不同發(fā)酵培養(yǎng)基對富硒產朊假絲酵母生長的影響Table 2 Effects of different fermentation mediums on the growth of selenium-enrichedC.utilis

由表2可知,酵母在G改良培養(yǎng)基中生長最好,硒轉化率高,生物量為8.91 g/L,有機硒含量為1 134.37 μg/g,GSH含量為124.01 mg/L；在S培養(yǎng)基中富硒效果較好,有機硒為1 225.56 μg/g,生物量較低7.07 g/L。綜合考慮選擇G改良配培養(yǎng)基進一步試驗。

2.2 高生物量富硒產朊假絲酵母發(fā)酵培養(yǎng)基關鍵因子的確定

以G改良培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基。采用二水平PB試驗設計對培養(yǎng)基各組分進行優(yōu)化,試驗設計與結果如表3所示。

表3 Plackett-Burman試驗設計方案及試驗響應值Table 3 Design and response values of Plackett-Burman experiments

表4 富硒產朊假絲酵母生物量回歸方程系數(shù)顯著性檢驗Table 4 Regression coefficient and their significance for biomass ofselenium-enrichedC.utilis

由表3、表4可知,試驗選取的12個因素中4個因素達到顯著性影響水平,顯著程度由高到低依次為葡萄糖(P＜0.000 1),KH2PO4(P=0.005),蛋白胨(P=0.017),CuSO4(P=0.023),其余各因素不顯著(P＞0.05),因此選擇這4個因素進行后續(xù)試驗。各因素對酵母的生長影響不同,葡萄糖、蛋白胨、KH2PO4、MnSO4、CuSO4、肌醇、ZnSO4與酵母的生長呈正相關,促進酵母生長,Box-Behnken(BB)試驗時應提高水平；其余與酵母生長負相關,下一步應降低水平。酵母體內存在兩種硒轉運方式——高硒親和系統(tǒng)和低硒親和系統(tǒng)；兩種轉運通道都離不開葡萄糖的作用,葡萄糖可以促進細胞對硒的吸收[16],但葡萄糖含量過高時,培養(yǎng)基滲透壓太大會造成微生物會脫水、脫離正常生理狀態(tài),因此BB試驗時保持葡萄糖含量水平不變。蛋白胨是含有一些維生素和糖類的有機氮化合物,對菌體生長影響較大,可以促進產朊假絲酵母的生長和對硒的富集[17]。磷、K+是構成菌體核酸、輔酶、酶的激活劑,直接或間接影響著酵母細胞的生長和代謝。磷酸根離子影響啤酒酵母對硒的積累,KH2PO4有利于酵母對硒的吸收[18]。Cu2+是多種氧化酶的活性中心,適當?shù)腃u2+可以促進酵母細胞的生長[19]。

2.3 響應曲面法優(yōu)化富硒產朊假絲酵母生長工藝

2.3.1 預測模型的建立及回歸分析檢驗

根據(jù)PB試驗結果,采用Box-Behnken試驗,以富硒酵母生物量(R1)為響應值,顯著影響因子的不同水平為自變量,進行優(yōu)化,每個自變量低、中、高水平分別為-1、0、1,試驗因素水平及編碼如表5所示,試驗結果響應值見表6,方差分析見表7。

表5 Box-Behnken設計試驗因素與水平Table 5 Factors and levels of Box-Behnken experiments

以生物量(R1)為響應值進行二元回歸擬合,獲得酵母生物量預測值對編碼自變量葡萄糖、蛋白胨、KH2PO4、CuSO4的二次多項回歸方程:

由表7模型的方差分析可知,試驗所采用的二次項模型具有顯著性(P＜0.000 1)；失擬項(P=0.148 3＞0.05)不顯著。其中校正決定系數(shù)R2adj=0.981 8,說明該模型擬合效果較好,該方程中的因變量與4個自變量之間線性關系顯著,方程可以用來解釋98.18%的變異,總變異中僅1.82%不能由該模型解釋。因此可以選用該回歸方程進行相應的預測。

表6 Box-Behnken試驗設計及結果Table 6 Design and results of Box-Behnken experiments

表7 回歸方程方差分析及其顯著性檢驗Table 7 Variance analysis and significance testing of regression equation

對方程的回歸系數(shù)進行顯著性檢驗(表7)表明,一次項中A、B、C(P＜0.05),說明葡萄糖、蛋白胨、KH2PO4對富硒酵母生長影響顯著,D項(P＞0.05)影響不顯著。交互項AD、BD(P＜0.05),表明葡萄糖和CuSO4,蛋白胨和CuSO4的交互作用對酵母生長影響顯著,其他交互項影響不顯著。二次項A2、B2、C2、D2(P＜0.05),說明4個因子對響應值的影響不是簡單的線性關系,曲面效應顯著。響應面結果見圖1。

圖1 葡萄糖和硫酸銅、蛋白胨和硫酸銅交互作用對富硒產朊假絲酵母生物量影響的響應曲面及等高線Fig.1 Response surface plots and contour line of effects of interaction between glucose and CuSO4,peptone and CuSO4on biomass of selenium-enrichedC.utilis

2.3.2 回歸模型驗證試驗

根據(jù)回歸模型得到富硒酵母生物量預測最大值為12.14 g/L,對應4個因子的取值分別為葡萄糖31.04 g/L、蛋白胨16.81 g/L、KH2PO46.65 g/L、CuSO40.01 g/L。為方便實際操作,修改條件為葡萄糖30 g/L、蛋白胨17 g/L、KH2PO46.5 g/L、CuSO40.01 g/L。對上述條件進行驗證性試驗,優(yōu)化后生物量為12.01 g/L,GSH為134.27 mg/L,有機硒為1 337.46 μg/g,較優(yōu)化前分別提高了36%、14%和20%。

2.4 亞硒酸鈉對酵母生長的影響

由表8可知,亞硒酸鈉添加量較低時對酵母生長影響較小,胞內GSH含量穩(wěn)定,但有機硒富集也較少；隨著添加量增加,有機硒含量增加；亞硒酸鈉添加量＞30μg/mL時,胞內GSH顯著降低,菌體大量死亡。亞硒酸鈉添加量為30μg/mL時,酵母生物量為11.21 g/L,有機硒為1 673.32 μg/g,谷胱甘肽為126.80 mg/L。

表8 亞硒酸鈉添加量對朊假絲酵母性能影響Table 8 Effect of sodium selenite addition on the performances of C.utilis

3 結論

采用響應面法對酵母生長培養(yǎng)基優(yōu)化結果為葡萄糖30 g/L、蛋白胨17 g/L、KH2PO46.5 g/L、CuSO40.01 g/L。在此條件下酵母生物量為12.01 g/L,有機硒1 337.46 μg/g,谷胱甘肽134.27 mg/L。將培養(yǎng)基中亞硒酸鈉添加量由25 μg/mL提高至30 μg/mL,酵母生物量為11.21 g/L,有機硒為1 673.32 μg/g,谷胱甘肽為126.80mg/L。該研究為高性能富硒產朊假絲酵母深入研究奠定了基礎。

[1]MAREK K,KIELISZEK M,STANISIAW B.Current knowledge on the importance of selenium in food for living organisms:a review[J].Molecules,2016,21(5):609-624.

[2]KIELISZEK M,BLAZEJAK S,GIENTKA I,et al.Accumulation and metabolism of selenium by yeast cells[J].Appl Microbiol Biot,2015,99(13):5373-5382.

[3]ZHAN X A,QIE Y Z,WANG M,et al.Selenomethionine:an effective selenium source for sow to improve Se distribution,antioxidant status,and growth performance of pig offspring[J].Biol Trace Elem Res,2011,142(3):481-491.

[4]PéREZ-CORONA M T,SáNCHEZ-MARTíNEZ M,VALDERRAMA M J,et al.Selenium biotransformation bySaccharomyces cerevisiaeand Saccharomyces bayanusduring white wine manufacture:laboratory-scale experiments[J].Food Chem,2011,124(3):1050-1055.

[5]WANG Z,ZHANG L Y,TAN T W.High cell density fermentation of Saccharomyces cerevisiaeGS2 for selenium-enriched yeast production[J].Kor J Chem Eng,2010,27(6):1836-1840.

[6]WANG D H,YANG B,WEI G Y,et al.Efficient preparation of Selenium/glutathione-enrichedCandida utilisand its biological effects on rats[J].Biol Trace Elem Res,2012,150(1-3):249-257.

[7]WANG D H,ZHANG J L,DONG Y Y,et al.Glutathione is involved in physiological response ofCandida utilisto acid stress[J].Appl Microbiol Biot,2015,99(24):10669-10679.

[8]YIN H F,CHEN Z G,GU Z X,et al.Optimization of natural fermentative medium for selenium-enriched yeast by d-optimal mixture design[J].LWT-Food Sci Tech,2009,42(1):327-331.

[9]SUHAJDA A,HEGOCZKI J,JANZS B,et al.Preparation of seleniumenrichedSaccharomyces cerevisiae[J].J Trace Elem Med Biol,2000,14(1):43-47.

[10]鄒 艷,李俊杰,管 斌,等.高生物量富硒產朊假絲酵母菌株的選育[J].中國釀造,2017,36(5):85-89.

[11]楊 波.富硒產朊假絲酵母的制備及性能研究[D].蘇州:蘇州大學,2012.

[12]CATALINO G,AKIHISA KANDA,et al.Effect of amino acids on glutathione production bySaccharomyces cerevisiae[J].Appl Microbiol Biotechnol,1992,36:538-540.

[13]吳寶強,梁海秋,楊 輝,等.高生物量富硒酵母的選育和培養(yǎng)條件的初步研究[J].現(xiàn)代食品科技,2005,21(2):35-39.

[14]KIELISZEK M,BIAZEJAK S,KUREK E.Binding and conversion of selenium inCandida utilisATCC 9950 yeast in bioreactor culture[J].Molecules,2017,22(3):1-11.

[15]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].北京:化學工業(yè)出版社,2015:512.

[16]ROSEN B R,LIU Z J.Transport pathways for arsenic and selenium:a minireview[J].Environ Int,2009,35(3):512-515.

[17]原國強,楊 輝,梁海秋,等.富硒酵母的選育及其發(fā)酵條件的優(yōu)化試驗[J].食品科技,2007,32(5):25-28.

[18]LAZARD M,BLANQUET S,FISICARO P,et al.Uptake of selenite by Saccharomyces cerevisiaeinvolves the high and low affinity orthophosphate transporters[J].J Biol Chem,2010,285(42):32029-32037.

[19]張 敏,王立芹.微量元素銅的營養(yǎng)學研究進展[J].中國飼料添加劑,2014(9):10-14.

[20]KIELISZEK M.B?AZ˙EJAK S,BZDUCHA-WRóBEL A,et al.Effects of selenium on morphological changes inCandida utilisATCC 9950 yeast cells[J].Biol Trace Elem Res,2016,169(2):387-393.