諾麗酒增強免疫功能的實驗研究

孟 君,滕 暉,張 凱,唐 雪,李曉娟*

(1.株洲千金藥業股份有限公司,湖南 株洲 412000；2.江南大學 食品學院,江蘇 無錫 214122)

諾麗(Morinda citrifoliaL.)又名海巴戟天、海巴戟,是南太平洋島國及其他熱帶、亞熱帶地區生長的小型灌木或喬木,已有2 000多年的歷史[1-2],在我國海南、西沙、臺灣亦有種植。諾麗果富含多種必需氨基酸、維生素、微量元素、多糖等營養成分[3]以及酚類、黃酮類等植物活性物質[4],具有清除自由基、抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、抗炎癥、緩解疼痛、提高免疫力等功效[5]。研究表明,諾麗果汁含有豐富的多糖類、三萜類、環烯醚萜類及抗氧化物質,能激活細胞免疫系統(包括NK細胞、巨噬細胞、T淋巴細胞),刺激胸腺發育[6],促進炎癥細胞因子的釋放以增強免疫力[7],對多種疾病有預防和治療作用。諾麗作為一種新興保健食材,在西方社會的普及程度日益提高[8]。2010年,諾麗果漿已獲批為我國新食品原料,對于諾麗果的加工和利用也在不斷的改進和創新。

諾麗酒是以諾麗果汁為原料,結合現代新工藝自主研究制作的一款果酒,并依據傳統中藥組方加入枸杞、龍眼、黃精、紅棗、人參等中藥成分,具有補益心脾、養血安神、健脾潤肺、補氣養陰等功效。本研究分別從細胞免疫功能、體液免疫功能、單核-巨噬細胞功能、NK細胞活性和血清細胞因子水平5個方面評價了諾麗酒的免疫增強作用,以期為諾麗酒的保健研究和開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料

諾麗酒(酒精度為9%vol):株洲千金藥業股份有限公司。

1.1.2 培養基與試劑

RPMI1640細胞培養基:南京建成生物工程研究所；刀豆蛋白A(concanavalinA,ConA)、沒食子酸(純度≥98%):美國Sigma公司；印度墨汁:北京索萊寶科技有限公司；綿羊紅細胞、豚鼠血清:南京森貝伽生物技術有限公司；細胞因子測定試劑盒:廈門慧嘉生物科技有限公司；蘆丁(純度≥98%):上海哈靈生物科技有限公司；Hank's液、胎牛血清:美國Gibco公司；YAC-1細胞:北京北納科技有限公司。

1.2 儀器與設備

BioTek Epoch全波長酶標儀:美國Biotek公司；5804R離心機:德國Eppendorf公司；BBD6220細胞培養箱:美國ThermoFisher公司；FACSCalibur流式細胞儀:美國BD公司。

1.3 方法

1.3.1 釀造工藝流程

1.3.2 動物與分組

240只C57BL/6J小鼠(4周齡,(12.09±0.27)g):上海斯萊克實驗動物有限責任公司,飼喂于江南大學實驗動物中心。采用12/12 h光照周期(8∶00-20∶00),恒溫(23±2)℃,恒濕(60±5)%條件,所有實驗操作均按照江南大學動物使用和福利協會要求進行。

預飼1周后,小鼠隨機分為:①空白組(CON,10只),灌胃生理鹽水0.2 mL；②酒基對照組(CON-WB,10只),灌胃含9%乙醇生理鹽水0.2mL；③蜂膠組(陽性對照,CON-PRO,10只),灌胃含10%蜂膠的溶液0.2 mL；④低/中/高劑量諾麗酒組(L-NONI/M-NONI/H-NONI,每組10只),灌胃10mL/kg體質量、20mL/kg體質量、40mL/kg體質量諾麗酒。整個實驗周期為45 d,所有動物每天相同時間點灌胃1次,自由進食、飲水。

1.3.3 分析檢測方法

蛋白質含量測定:采用GB5009.5—2010《食品中蛋白質的測定》凱氏定氮法；粗脂肪含量測定:采用GB/T 5009.6—2016《食品中粗脂肪的測定》索氏抽提法；總糖與還原糖含量測定:采用GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》斐林試劑滴定法；總多酚(以沒食子酸計):Folin-Ciocaleu法[9]；總黃酮:分光光度法[10]；增強免疫功能測定:參照衛生部《保健食品檢驗與評價技術規范》(2013版)中增強免疫力功能檢驗方法。

1.3.4 小鼠體質量及臟器指數

最后一次給藥后禁食12 h,稱體質量后脫臼處死,取脾臟、胸腺,去盡筋膜,用濾紙吸干表面血污,稱質量,臟器指數計算公式如下:

1.3.5 細胞免疫功能測定

小鼠脾淋巴細胞轉化實驗采用四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法[11]:取6孔板,孔板上放置200目細胞篩,加入4 mL Hank's液,無菌取小鼠脾臟后置于細胞篩上,用注射器內芯磨碎,制成單細胞懸液,再用Hank's液洗滌兩次。將細胞懸浮于2 mL完全培養基中,計數,調整濃度為3×106個/mL。取懸液1 mL于6孔板中(兩孔),一孔加入100 μg/mL ConA75 μL,另一孔作為對照孔。置于細胞培養箱培養72 h。培養結束前4 h,吸去上清0.7 mL,加入0.7 mL不含小牛血清的RPMI1640培養基,同時加入MTT 50 μL/孔,繼續培養4 h。培養結束后,毎孔加入1 mL酸性異丙醇,吹打使紫色結晶完全溶解,分裝到96孔板中,于波長570 nm處測吸光度值。以加入ConA孔的光密度減去不加ConA孔的光密度值代表淋巴細胞的增值能力。脾淋巴細胞增值能力計算公式如下:

二硝基氟苯誘導的遲發型變態反應實驗采用耳腫脹法[11]:取二硝基氟苯50 mg與5 mL丙酮麻油溶液(丙酮∶麻油=1∶1)混勻。小鼠腹部用8%硫化鈉溶液脫毛后,用50 μL二硝基氟苯溶液均勻涂抹。5 d后,用二硝基氟苯溶液10 μL均勻涂抹于小鼠一側耳朵。24 h后,用打孔器取下耳片,稱質量,耳片質量差值表示遲發型變態反應強弱。耳腫脹率計算公式如下:

1.3.6 體液免疫功能測定

抗體生成細胞檢測[11]:實驗5 d前小鼠腹腔注射2%綿羊紅細胞0.2 mL。取0.5 g瓊脂糖加入100 mL生理鹽水中,加熱溶解,50℃時以1 mL/孔加入6孔板中,冷卻凝固后,作為底層培養基。取0.5g瓊脂糖加入100mLHank's液中,加熱溶解,以0.5 mL/管加入試管中50℃保溫,作為頂層培養基。無菌取小鼠脾臟制成單細胞懸液,調整濃度為1×107個/mL。取脾細胞懸液200 μL,20%綿羊紅細胞50 μL加入頂層培養基中,迅速混勻,倒入底層培養基上。培養板放入細胞培養箱培養1 h,毎孔加入500 μL用培養基稀釋10倍的補體,孵育2 h。結果以空斑數/106脾細胞數表示。

血清溶血素測定采用半數溶血值(halfhemolyticvalue,HC50)法:實驗5 d前小鼠腹腔注射2%綿羊紅細胞0.2 mL。小鼠眼球取血,放置1 h后4 000 r/min離心10 min,收集血清。樣品管:取血清10 μL,用1 mL 5倍稀釋的SA緩沖液(C4H4N2O30.46g,MgCl20.1g,CaCl2·2H2O0.2g,NaCl8.38g,NaHCO30.252 g,C8H11N2NaO30.3 g,加蒸餾水至1 000 mL)稀釋,在離心管中加入100 μL。空白管:加入100 μL 5倍稀釋的SA緩沖液。毎管依次加入10%綿羊紅細胞50 μL,補體100 μL。37℃保溫30 min,1 500 r/min離心10 min。樣品管與空白管各取50 μL于96孔板中,加入都氏試劑150 μL。半數溶血空加入10%綿羊紅細胞12.5 μL,加都氏試劑187.5 μL,放置10 min。在波長540 nm處測吸光度值。半數溶血值計算公式如下:

1.3.7 單核-巨噬細胞功能測定

小鼠碳廓清實驗:小鼠稱體質量,按毎10 g體質量0.1 mL從尾靜脈注射用生理鹽水稀釋3倍的印度墨汁。注入后2 min、10 min,分別從小鼠內眥靜脈叢取血20 μL,并立即加入到2 mL 0.1%Na2CO3溶液中。于波長660 nm處測吸光度值。吞噬指數a計算公式如下:

式中:OD1為2 min時的吸光度值；OD2為10 min時的吸光度值；t1為第一次取血時間；t2為第二次取血時間。

小鼠腹腔吞噬熒光微球實驗:實驗前5 d給小鼠腹腔注射0.2mL2%綿羊紅細胞激活小鼠巨噬細胞。頸椎脫臼處死小鼠,腹腔注射加小牛血清的Hank's液3 mL/只,輕揉3 min,再將腹水吸出,調整巨噬細胞濃度為(4～6)×105/mL。取巨噬細胞1 mL于6孔板中,加入熒光微球(1×107/板),置于細胞培養箱孵育2 h,孵育后棄上清,用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)洗滌2次。200目篩網過濾后上流式細胞儀分析。巨噬細胞吞噬熒光微球吞噬率計算公式如下:

1.3.8 NK細胞活性測定

靶細胞制備:實驗前24 h將YAC-1細胞傳代培養,用培養基調整細胞濃度為4×105個/mL。效應細胞制備:小鼠無菌取脾并制成單細胞懸液,調整濃度為2×107個/mL。取靶細胞和效應細胞各100 μL加入U形96孔板；靶細胞自然釋放孔加靶細胞和培養基各100 μL；靶細胞最大釋放孔加靶細胞和2.5%曲拉通各100 μL。置于細胞培養箱中孵育4 h,取出后1 500 r/min離心5 min,取上清100 μL置于96孔板中,同時加入乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)基質液100 μL,靜置3 min,毎孔加1 mol/L HCl 30 μL,波長490 nm處測吸光度值。NK細胞活性計算公式如下:

1.3.9 細胞因子測定

小鼠采用摘除眼球方法取血,分離血清,按照酶聯免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒說明書操作,測定小鼠血清中白細胞介素(interleukin,IL)-1、IL-6、IL-10以及腫瘤壞死因子(tumournecrosisfactor,TNF)-α含量。

1.3.10 數據處理

實驗數據采用SPSS Statistics 23分析處理,以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 諾麗酒主要營養成分

由表1可知,諾麗酒中蛋白質含量為(0.25±0.02)g/100mL,粗脂肪含量為(0.97±0.01)g/100 mL,總糖和還原糖含量分別為(6.21±0.09)g/100 mL和(5.49±0.10)g/100 mL。諾麗酒的總多酚和總黃酮含量豐富,分別為(553.60±0.82)μg/mL與(230.56±1.68)μg/mL,具有降脂、抗氧化、抗炎、鎮痛、抗腫瘤等多種功效[12]。

表1 諾麗酒的營養成分及活性物質分析Table 1 Analysis of nutritional components and active substances of Noni wine

2.2 小鼠體質量及臟器指數

脾臟和胸腺是動物機體內重要的免疫器官,是免疫細胞產生、分化、成熟、增值的主要場所。免疫器官的質量是反應機體非特異性免疫的重要指標[13]。由表2可知,連續灌胃45 d后,三個劑量諾麗酒組與CON-WB組相比均無顯著性差異(P＞0.05),表明諾麗酒對小鼠體質量和免疫臟器指數無明顯影響。

表2 小鼠體質量及臟器指數Table 2 Body mass and visceral indexes of mice

2.3 細胞免疫功能

表3 小鼠細胞免疫功能Table 3 Cellular immune function of mice

當T淋巴細胞受到ConA刺激后發生母細胞增值反應,分化成為效應T細胞,具有細胞免疫的功能[14]；遲發性變態反應是由致敏性T細胞與相應的抗原結合,引起單核細胞浸潤和細胞變性壞死的局部變態反應炎癥,炎癥反應的強弱可以反應細胞免疫能力的高低[15]。由表3可知,與CON-WB組相比,中、高劑量諾麗酒可顯著提高小鼠脾淋巴細胞轉化能力(P＜0.05),但對遲發型變態反應沒有效果。PALU A K等[16]研究表明,諾麗果中的寡糖成分對正常小鼠脾淋巴有明顯的促進增殖作用,并能增加脾細胞產生抗體數目,提高小鼠免疫力。結果表明,諾麗酒提高小鼠細胞免疫功能的作用可能與其保留了諾麗果中的有效功能成分有關。

2.4 體液免疫功能

綿羊紅細胞與經過綿羊紅細胞免疫的小鼠脾細胞懸液混合后,脾細胞分泌的抗體可使其周圍的綿羊紅細胞發生溶解,形成肉眼可見的空斑。經過免疫的小鼠血清中含有抗綿羊紅細胞的抗體,可以溶解綿羊紅細胞,釋放血紅蛋白,通過測定血紅蛋白含量可以反應動物抗體產生量[17]。由表4可知,三個劑量諾麗酒對溶血空斑和HC50值均無顯著性影響(P＞0.05),表明諾麗酒不具有增強體液免疫功能作用。

表4 小鼠體液免疫功能Table 4 Humoral immune function of mice

2.5 單核-巨噬細胞功能

巨噬細胞具有吞噬異物的非特異性免疫功能,在體內參與免疫防御,能有效清除病原體,當異物入侵機體后,即可被巨噬細胞迅速吞噬,因此,巨噬細胞的吞噬能力是反應機體非特異性免疫的一項重要指標[18]。SASMITO E等[19]的研究表明,諾麗果汁中豐富的多糖類物質可顯著提高巨噬細胞吞噬功能。由表5可知,與CON-WB組相比,中、高劑量諾麗酒可顯著提高碳廓清吞噬指數和巨噬細胞吞噬熒光微球吞噬率(P＜0.05),表明諾麗酒具有增強單核-巨噬細胞活性功能。

表5 小鼠單核-巨噬細胞活性Table 5 Monocyte-macrophage activity of mice

2.6 NK細胞活性

NK細胞是一種沒有T和B細胞表面標志的淋巴細胞,具有非特異性殺傷功能,具有抗腫瘤、抗感染等作用,是機體內重要的免疫細胞。崔英等[20]研究表明,植物多酚具有較強的抗氧化和免疫細胞調節作用。FURUSAWA E等[21]研究表明,諾麗果汁中的多糖類物質可明顯提高小鼠體內NK殺傷能力。由表6可知,中、高劑量諾麗酒可顯著提高小鼠NK細胞活性(P＜0.05),表明諾麗酒中含有的多酚及多糖物質可能是提高NK細胞活性的主要活性物質。

表6 小鼠NK細胞活性Table 6 NK cell activity of mice

2.7 細胞因子含量

巨噬細胞是機體免疫的重要成員,具有殺傷、吞噬、分泌活性物質、遞呈抗原、調控機體免疫以及抑制腫瘤等多種活性,活化后的巨噬細胞能分泌近百種與免疫應答及炎癥密切相關的活性物質[22]。由表7可知,諾麗酒對IL-1的分泌無顯著性影響(P＞0.05),但可顯著提高IL-6、IL-10和TNF-α分泌(P＜0.05)。IL-6能活化T細胞并產生淋巴因子,能使B細胞前體成為產生抗體的細胞,增強自然殺傷細胞的裂解功能；IL-10為一種細胞因子合成抑制劑和巨噬細胞失活劑,抑制內毒素入侵引起的促炎癥因子釋放,同時還能促進B細胞增殖和抗體產生[23]；TNF-α可殺傷或抑制腫瘤細胞,提高中性粒細胞的吞噬能力[8]。SUN W J等[24]的研究表明,多糖是諾麗果中的重要活性成分,能夠激發IL-1、IL-10、TNF-α、TFN-γ等炎癥細胞因子的釋放,促使機體的免疫系統能力提升,表明諾麗酒的免疫調節作用與影響細胞因子水平有關。

表7 小鼠血清細胞因子水平Table 7 Serum cytokine levels of mice

3 結論

以10 mL/kg體質量、20 mL/kg體質量、40 mL/kg體質量劑量的諾麗酒灌胃小鼠45 d,結果表明,各劑量組對小鼠體質量、胸腺指數和脾臟指數無顯著性影響(P＞0.05)。20 mL/kg體質量和40 mL/kg體質量劑量諾麗酒組的脾淋巴細胞增值能力、巨噬細胞吞噬活力及NK細胞活性均顯著高于空白對照組與酒基對照組,并且血漿中IL-6、IL-10與TNF-α含量也顯著高于空白對照組與酒基對照組,表明中高劑量的諾麗酒可以促進小鼠體內細胞因子的釋放,從而提高小鼠體內免疫應答能力,增強機體免疫力。

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