不同高粱品種釀造醬香型白酒發酵特性的研究

郭 敏,保玉心*,黃永光,黃蘊利

(1.貴州大學 釀酒與食品工程學院,貴州 貴陽 550025；2.遵義醫學院,貴州 遵義 563000；3.貴州大學 貴州省發酵工程與生物制藥重點實驗室,貴州 貴陽 550025)

中國白酒是世界上最古老的蒸餾酒之一,通常由谷物發酵釀造而成。高粱因具有高含量的淀粉、低含量蛋白質和脂肪等特性,成為白酒釀造的首選原料。高粱對于白酒釀造的重要性,正如葡萄對葡萄酒和大麥對威士忌釀造一樣[1-2]。在中國,傳統白酒的年生產及消費量均非常大,因此對高粱的需求量也很大。由于白酒釀造耗糧大,大量國外高粱(如加拿大、澳大利亞等地產高粱)也進口到中國,作為白酒釀造原料。然而,進口高粱是否適宜釀造中國白酒、優質白酒,以及對中國白酒釀造質量的影響如何,仍未見詳細報道。

原料是白酒釀造的物質基礎,不同原料具有不同的成分結構、含量及釀造特性,用其釀酒,自然會產生不同的質量和風格[3]。高粱除富含淀粉、蛋白質外,還含有各種營養元素,如無機元素、維生素等,可為釀造微生物的生長、繁殖及代謝提供物質基礎。又如高粱中含有的單寧,味苦澀、性收斂,對酶有鈍化作用,降低發酵力,但適量的單寧可提高酒醅的發酵率。同時,單寧經蒸煮發酵,可轉變成芳香物質,如丁香酸等,賦予白酒特殊的香氣,并可抑制雜菌的生長[4]。高粱根據其淀粉組成結構及比例不同,可分為粳高粱和糯高粱。不同香型白酒、不同地域白酒的釀造,除就地擇梁生產外,也多會選擇其他地區種植的高粱。中國白酒根據其風格特征可分為濃香、清香、醬香、芝麻等12種香型白酒[5]。西南地區生產的以茅臺酒為代表的醬香型白酒多以糯高粱為原料,而北方生產的酒多以粳高粱為原料釀制。近年,許多研究人員對高粱原料對白酒釀造特性及其產酒影響進行了研究,WU Q等[6-7]的研究表明,糯高粱、粳高粱原料所產酒的風味存在明顯差異；田殿梅等[8]研究表明,不同淀粉結構高粱原料的釀造特性存在差異；袁蕊等[9]研究表明,糯高粱更容易糊化；李奇[10]報道支鏈淀粉含量高的高粱出酒率較高；蛋白質含量過高會導致氨基酸降解產生過多的雜油醇[11]；AI Y等[12]研究發現,單寧含量低的高粱原料釀酒具有更高的乙醇生產速率。孫家芳[13]對白酒釀造原料的選用標準進行了初步探討,但也只是根據當地企業的實際情況自行制定出一套針對原料基本理化指標的標準。

米曲霉(Aspergillus oryzae)是白酒釀造過程主要的糖化菌之一,可分泌各種釀酒過程所需酶類,如通過分泌產生糖化酶等酶類對原料進行利用,產生各種風味成分[14-17]。釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是釀酒過程最重要且最常見的功能微生物,對產乙醇、風味化合物、酒體質量和產量均具有顯著影響[18]。因此,本課題主要對釀酒高粱原料的釀酒品質進行分析研究,擬從高粱原料釀造品質評價體系方面提供科技支撐,以米曲霉和釀酒酵母為發酵動力源,以不同產地的高粱為原料模擬固態發酵,研究不同高粱的醬香型白酒釀造發酵特性。擬進一步揭示不同原料對醬香型白酒釀造的影響,為其規模化應用提供參考基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 高粱樣品

樣品B1:四川產糯高粱；樣品B2:貴州仁懷產紅纓子糯高粱；樣品B3、B4:中國北方產粳高粱；樣品B5、B6:加拿大產粳高粱；樣品B7、B8:澳大利亞產粳高粱；樣品B9、B10:中國東北產粳高粱。

1.1.2 化學試劑

高溫α-淀粉酶(酶活50 000 U/g):北京生東科技有限公司；糖化酶(酶活100 000 U/g):國藥集團化學試劑有限公司；無水乙醇、三氯乙酸、無水氯化鈣、氯化鈉(均為分析純):中國醫藥(集團)上海化學試劑有限公司；酵母粉(生化試劑):英國Oxoid公司；葡萄糖(分析純):天津市永大化學試劑有限公司。

1.1.3 培養基

酵母浸出粉胨葡萄糖(yeast extract peptone dextrose medium,YEPD)培養基:酵母粉10 g/L,蛋白胨20 g/L,葡萄糖20 g/L,于121℃滅菌20 min備用。

察氏(Czapek-Dox)培養基:硝酸鈉3 g/L,磷酸氫二鉀1 g/L,硫酸鎂(MgSO4·7H2O)0.5 g/L,氯化鉀0.5 g/L,硫酸亞鐵0.01 g/L,蔗糖30 g/L,瓊脂20 g/L,蒸餾水1 000 mL,加熱溶解,分裝后121℃滅菌20 min。

米曲霉發酵培養基:將察氏培養基中的碳源調整為質量濃度為2.5 g/L的不同品種高粱淀粉,于121℃滅菌20 min備用。

固態發酵培養基:按3∶5比例將高粱與水混合,70～80℃浸泡24h,將水瀝干,高溫蒸煮糊化2h,于121℃滅菌15min備用。

高粱汁培養基:將高粱粉碎后,按照1∶4的比例將高粱與水混勻,加入高溫α-淀粉酶(50 U/kg)進行2 h蒸煮糊化,迅速冷卻至60℃以下后加入糖化酶(100 U/kg),于60℃水浴下進行4 h糖化,離心過濾取得上清液為高粱汁培養基,于121℃滅菌15 min備用。

1.1.4 菌株

菌株分離于貴州XJ公司生產用醬香大曲、堆積發酵醬香酒醅,根據前期菌株發酵特性研究結果,選釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)YM1、YM2,米曲霉(Aspergillus oryzae)XJDJQM03菌株為本研究的試驗菌株。

1.2 儀器與設備

1200型液相色譜儀:美國Agilent公司；DHP-9272A型恒溫培養箱:上海躍進醫療器械一廠；Nanodrop 8000微量分光光度計:美國Thermo Scientific公司；電子天平:美國Mettler-Toledo公司；AvantiJ-E高速冷凍離心機:美國Beckman Coulter公司。

1.3 方法

1.3.1 模擬發酵方法及操作要點

固態發酵工藝參考黃永光[19]的方法,具體發酵工藝參數及操作要點參見文獻[20-21]。

1.3.2 不同高粱原料米曲霉發酵特性

為研究不同高粱原料在白酒釀造過程的發酵特性,以不同來源和品種的高粱淀粉為碳源,進行米曲霉XJDJQM03菌株的不同高粱汁發酵實驗,通過測定米曲霉XJDJQM03生物量和產葡萄糖含量,考察不同高粱原料的米曲霉發酵特性。

1.3.3 不同高粱原料釀酒酵母發酵特性

在白酒釀造過程,釀酒酵母(S.cerevisiae)是產生乙醇和風味物質的主要功能微生物。因此,為了研究、證實不同高粱原料的釀造發酵特性。本研究中重點對2種糯高粱樣品B1、B2和4種粳高粱樣品 B3、B4、B5、B6進行模擬釀造發酵對比分析。在初始還原糖濃度相同下,分別采用釀酒酵母菌株YM1、YM2進行發酵實驗,通過測定釀酒酵母生物量、還原糖消耗量及乙醇產量,考察不同高粱原料的釀酒酵母發酵特性。

1.3.4 分析檢測

米曲霉XJDJQM03生物量測定:將菌體懸液過濾并用蒸餾水離心洗滌,烘干至恒質量并稱質量。釀酒酵母菌株YM1、YM2生物量的測定:采用YEPD平板培養計活菌數。

米曲霉XJDJQM03降解高粱淀粉分析:制備米曲霉XJDJQM03孢子懸浮液并計濃度,按5.0×105CFU/mL接種量接種于發酵培養基,30℃、250r/min條件下振蕩培養72h。采用3,5-二硝基水楊酸(3,5-dinitrosalicylic acid,DNS)方法進行還原糖測定[22]。

葡萄糖標準曲線制作:準確稱量1.00 g無水葡萄糖,用去離子水溶解后定容至1000mL,制得質量濃度為1.00mg/mL葡萄糖儲備液,分別吸取 0、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6mL葡萄糖儲備液分別對應加入10 mL、9 mL、8 mL、7 mL、6 mL、5 mL、4 mL去離子水,制備成不同質量濃度的葡萄糖標準液,于波長520 nm條件下測定吸光度值。以葡萄糖含量(x)為橫坐標,吸光度值(y)為縱坐標繪制葡萄糖標準曲線。

乙醇含量測定:高效液相色譜法。色譜條件:Aminex HPX-87H色譜柱(300 mm×7.8 mm,9 μm),柱溫:60℃,流動相:3mmol/L硫酸溶液,流速:0.6mL/min,進樣量:10μL,檢測器:示差折光檢測器(differential refraction detector,RID)。乙醇標準曲線制定:配制不同濃度的乙醇標準溶液,根據乙醇質量濃度(x)和峰面積(y)制作乙醇標準曲線。

2 結果與分析

2.1 不同高粱品種米曲霉發酵

2.1.1 不同高粱品種米曲霉發酵的生物量變化

米曲霉XJDJQM03菌株的生長是發酵過程富集糖化動力糖化水解酶的基礎。對發酵過程菌株XJDJQM03的生物量變化進行測定,進一步分析不同原料對菌株XJDJQM03生長的影響。菌株XJDJQM03生物量隨發酵時間的變化結果見圖1。

圖1 不同高粱品種發酵過程中菌株XJDJQM03生物量的變化Fig.1 Changes of biomass of strain XJDJQM03 during fermentation process of different sorghum varieties

由圖1可知,菌株XJDJQM03生長速率(曲線斜率)在24 h內迅速增大,總的生物量在48 h時達到最大,不同高粱原料中富集的XJDJQM03菌株生物量呈現出一定的差異；48 h后生物量開始出現整體下降。由發酵72 h的生物量可知,高粱樣品B3、B4、B7、B8、B9和B10中菌株XJDJQM03生物量明顯高于高粱樣品B1和B2中菌株生物量。結果表明,粳高粱淀粉有利于菌株XJDJQM03的生長,在釀造過程菌株XJDJQM03有可能對粳高粱淀粉的利用率高于對糯高粱淀粉的利用,在以往的研究中粳高粱主要含有直鏈淀粉,糯高粱主要含有支鏈淀粉,且支鏈淀粉含量越高,淀粉的糊化越容易,這樣就更利于釀酒微生物的生長繁殖[23]。因此,對于不同高粱原料米曲霉發酵的生物量的發酵機理仍需進一步研究。

但在白酒的實際釀造過程,由于酒曲提供了非常豐富的微生物,包括大量的細菌和霉菌,因此可提供的酶類也相對豐富,各酶類的作用可以彼此互補、調節,所以在白酒釀造過程中酶不容易鈍化,在其他酶系的共酵下,對糯高粱的利用會更快。因此,在醬香型白酒釀造過程,當以支鏈淀粉含量更高的糯高粱作為釀造原料時,則要求在發酵過程中所使用的大曲必須提供更豐富的酶類,這可能就是高溫大曲與糯高粱的有機結合,釀造優質醬香型白酒的緣由之一。

2.1.2 不同高粱品種米曲霉發酵過程葡萄糖變化

不同高粱品種菌株XJDJQM03發酵產葡萄糖含量結果見圖2。

圖2 不同高粱品種發酵過程中葡萄糖含量變化Fig.2 Changes of glucose contents during fermentation process of different sorghum varieties

由圖2可知,隨著發酵時間進程葡萄糖的含量出現逐漸上升趨勢,在第4天時各高粱樣品對應發酵的葡萄糖積累量最高。且樣品B2對應發酵樣的葡萄糖產量最高,達到了168.78 mg/L以上。樣品B2為仁懷本地產紅纓子糯高粱,具有直鏈淀粉含量低、支鏈淀粉含量高[24]、糖化發酵好等特點。在微生物發酵過程中,淀粉需要首先被糊化,即吸水膨脹后,晶體結構消失,分解為小分子糊精,才能繼續被微生物所產生的酶分解利用。支鏈淀粉是樹枝狀的分支結構,而直連淀粉基本無分支,因此在糊化過程中,支鏈淀粉分支間的空隙更容易吸收水分子,進而膨脹糊化,在相同的糊化溫度及水分條件下,與直連淀粉相比,支鏈淀粉被糊化的程度更完全[25],而在經過高溫蒸煮之后的攤晾冷卻過程中,直鏈淀粉更容易發生短期的老化回生,這樣就可能導致微生物利用的困難。推測可能是發酵過程淀粉和其他成分更容易被米曲霉分泌酶系的利用,從而生成更多的葡萄糖,其深層次的發酵機理仍需進一步研究。相關研究也表明,直鏈淀粉含量較高的粳高粱不易被糊化[25],因此即使在相同的工藝下,也可能導致其被糖化的性能偏低,該推測在相關試驗中也得到了相應的印證[26]。因此,以產糖結果來看,高粱樣品B2在各實驗高粱樣品原料中占有明顯優勢,更適合釀造醬香型白酒,這與相關文獻報道一致[9]。

2.2 不同高粱品種釀酒酵母發酵特性

2.2.1 不同高粱品種發酵對釀酒酵母生物量的影響

釀酒酵母YM1和YM2在不同高粱品種發酵過程中的生物量變化結果見圖3。

圖3 不同高粱品種發酵過程中酵母菌株YM1(A)和YM2(B)生物量的變化Fig.3 Changes of biomass of strain YM1(A)and YM2(B)during fermentation process of different sorghum varieties

由于不同高粱原料的物質組成特性不同[27],原料中的不同物質成分在發酵過程被微生物的利用和影響微生物的生長自然存在一定差異,因此發酵菌株在不同高粱原料發酵過程的生物量變化存在差異。由圖3可知,就YM1菌株發酵來看,在高粱樣品B1、B2、B3發酵的前48 h內其生物量達到最大值,且高粱樣品B2在前48 h內其生物量達到最大后便進入穩態,最終生物量為0.80×108CFU/mL,高于其他高粱原料中的終點生物量。同時,高粱樣品B4、B6中的YM1菌株生物量則在發酵的72 h達到最高峰,比高粱樣品B1、B2、B3發酵中的生物量滯后24h,之后便開始快速下降；高粱樣品B5中的YM1菌株生物量則在發酵的96 h時才到達最大值,其可能與發酵底物的營養供給有關[23]。結果表明,高粱樣品B2發酵樣的生物量明顯高于其他樣品,分析其原因可能與高粱樣品B2的糯高粱及其特性有關。據報道,高粱中適量的單寧對微生物生長有積極作用[28]。高粱樣品B2為糯高粱,含支鏈淀粉較高,其淀粉和其他組分結構可能更有利于YM1菌株利用并促進其生長,發酵過程的生物量增加、富集要較粳高粱樣品B4、B5、B6更快,進入發酵期快,其中的具體機理有待于進一步研究分析。

在YM2菌株發酵過程,高粱樣品B2和B3在發酵的前48 h內其生物量達到最大后便進入下降態勢,最終生物量分別為0.17×108CFU/mL、0.45×108CFU/mL,這與YM1菌株的不同高粱原料發酵具有類似效果；而B1、B6中的生物量則在發酵的72 h時達到最高值；B4、B5原料發酵中的生物量則在發酵的96 h時才達到最高值。

發酵過程中釀酒酵母(S.cerevisiae)對乙醇的生成和風味物質的形成具有重要影響。在本研究中,除高粱樣品B1外的其他原料發酵過程中的YM1菌株的最大生物量普遍高于YM2菌株的最大生物量,該結果說明在高粱樣品B2、B3、B4、B5、B6原料發酵中除淀粉外,可能含有更有利于菌株YM1生長的營養物質組成,導致YM1菌株更好的生長和富集。再看YM1菌株發酵,高粱樣品B2原料發酵過程在前48 h內其生物量達到最大后便進入穩態,最終生物量高于其他高粱原料發酵中的終點生物量,因此高粱樣品B2更有利于YM1菌株穩定生長、富集和發酵代謝。

2.2.2 不同高粱品種發酵對還原糖消耗量的影響

以不同高粱品種為原料,考察在釀酒酵母YM1菌株、YM2菌株發酵過程,其還原糖的變化情況,結果如圖4所示。

圖4 酵母菌株YM1(A)和YM2(B)在不同高粱品種發酵過程中還原糖含量的變化Fig.4 Changes of reducing sugar contents during strain YM1(A)and YM2(B)fermentation process of different sorghum varieties

釀酒酵母(S.cerevisiae)存在于醬香型白酒發酵酒醅和大曲中,是釀造過程中的優勢酵母[29-30]。其具有發酵起酵快、發酵力強、對糖的利用力強等發酵特點,并且還具有較強的酒精耐受性[17],發酵代謝高產乙醇特性[27]。由圖4可知,各樣品高粱發酵結果均表明YM1菌株對發酵過程的還原糖利用速率高于YM2菌株。在菌株YM2的各樣品高粱發酵中,菌株YM2在對糯高粱發酵中還原糖的利用不如其他高粱原料。發酵過程還原糖被利用的效率與前述酵母的生長、乙醇的產量變化結果一致。

2.2.3 不同高粱品種發酵產乙醇的影響

乙醇產量是衡量高粱原料釀酒發酵特性的重要指標之一。不同高粱原料樣品在模擬釀酒發酵過程對發酵產乙醇的影響,結果如圖5所示。

圖5 酵母菌株YM1(A)和YM2(B)在不同高粱品種發酵過程中乙醇含量的變化Fig.5 Changes of ethanol contents during strain YM1(A)and YM2(B)fermentation process of different sorghum varieties

在菌株YM1發酵過程,各發酵樣的乙醇含量波動范圍較小(32.12～39.2 g/L),且發酵終點產乙醇含量差異不明顯,表明發酵過程各發酵樣之間的乙醇生成速率較為穩定,其中樣品B2發酵終點乙醇含量最高(39.2 g/L)。菌株YM2發酵過程,各樣品發酵過程的乙醇含量差異較明顯(16.17～39.26 g/L),且菌株YM2在高粱樣品B1和B2中代謝產生最少的乙醇,分別僅為16.17 g/L和27.42 g/L,表明YM2菌株不適用于糯高粱的發酵。

在相同還原糖含量條件下,除高粱樣品B5外的其他發酵樣中菌株YM1發酵代謝乙醇生成速率和終點濃度均高于菌株YM2,其中高粱樣品B2發酵樣中的菌株YM1發酵代謝乙醇質量濃度分別比菌株YM2發酵對應的乙醇質量濃度高15.2 g/L,這與菌株YM1在發酵過程的生物量普遍高于菌株YM2一致。該結果表明,雖然發酵初始還原糖濃度相同,但可能由于各發酵樣中除淀粉以外的營養組分,例如單寧、蛋白質、粗脂肪、粗纖維、灰分、維生素等不同,從而決定了酵母菌株YM1、YM2之間的生長和代謝差異,進而影響乙醇的代謝發酵。以上結果說明,本研究所選用高粱更適合于菌株YM1發酵產乙醇,尤其是高粱樣品B2更滿足醬香型白酒釀造發酵工藝特性。

3 結論

以不同產地、品種類別高粱為原料,進行米曲霉(Aspergillusoryzae)XJDJQM03模擬發酵,研究醬香型白酒釀造過程不同高粱原料的發酵特性。結果表明,菌株XJDJQM03在釀造過程對糯高粱的利用不如粳高粱；高粱樣品B2發酵更有利于發酵過程葡萄糖產量的富集。

釀酒酵母YM1、YM2以不同高粱為原料的發酵結果表明,糯高粱樣品B2相對其他高粱品種來講,更有利于菌株YM1的生長、代謝產乙醇,糯高粱的主要優勢在于其支鏈淀粉含量高[31],更有利于保障白酒釀造品質,紅纓子高粱為醬香型白酒釀造的主要原料。

從米曲霉XJDJQM03和釀酒酵母YM1、YM2菌株發酵過程的生物量、產糖、產乙醇富集結果來看,高粱樣品B2在發酵過程更有利于雙邊發酵的協同性,更能滿足醬香型白酒釀造的“一次投糧、九次蒸煮、八次發酵、七次取酒”的工藝特點和要求。

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