響應面法優化益生菌發酵青稞飲料工藝

易曉成,萬 萍*,白 娜

(1.四川工商職業技術學院 酒類與食品工程系,四川 都江堰 611830；2.成都大學藥學與生物工程學院,四川 成都 610106)

青稞是禾本科大麥屬的一種作物,主要分布在我國的青藏高寒地區[1]。青稞除含有豐富的碳水化合物、蛋白質和人體必需氨基酸外,還含有多種維生素,銅、鋅、錳等20余種礦物元素[2-3],是谷類作物中的佳品。它不僅是藏族人民重要的糧食,還具有其獨到的藥效,如除濕、止瀉等,可用于治療相關的疾病[4-5]。同時,由于青稞具有較高含量的β-葡聚糖,對降膽固醇、降血糖貢獻巨大[6-7]。因此,也成為食品加工的一個新的研究方向。

益生菌能促進宿主腸道菌群的生態平衡[8],其發酵所產生的乳酸是一種天然的防腐保鮮劑,可保持活性益生菌的穩定性、安全性,并能賦予產品酸爽的口感；同時,益生菌發酵所產生的乳酸菌素能有效地抑制病原菌和腐敗菌；另外,益生菌發酵過程中產生的種種生物活性物質具有降低膽固醇、降血糖、改善肝功能、提高免疫力等多重保健功能,對身體健康發揮著積極的作用[9-10]。目前青稞除用作口糧、焙烤食品和釀酒的原料外,青稞發酵飲料鮮有報道,國內僅馬長中等[11]采用單一乳酸菌LAB005證明了乳酸菌發酵青稞飲料是可行的,而采用益生菌(保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌)發酵青稞飲料的研究國內外尚鮮見報道。

以青稞為原料,利用酶工程技術得到含有適量碳源和氮源的青稞酶解液[12]。本研究以該青稞酶解液為原料,研究不同的發酵時間、發酵起始pH、發酵溫度、益生菌接種量等因素對發酵的影響；并以發酵酸度為響應值,采用響應面法對益生菌發酵青稞飲料的發酵工藝進行優化,以期為青稞飲料的研發提供參考,對青稞的有效開發及產業的發展起到積極的推動作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青稞:市售；直投式益生菌發酵劑(保加利亞乳桿菌(Lactobacillus bulgaricus)與嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)):北京川秀科技有限公司；碳酸鈉(分析純):成都市科龍化工試劑廠；青稞酶解液:本實驗室提供。

1.2 儀器與設備

GNP-9270型恒溫培養箱:上海齊欣科技有限公司；LD型電子天平:沈陽龍騰電子有限公司；pHS-3C型酸度計:成都世紀方舟科技有限公司；SW-CJ-2D型無菌操作臺:蘇州凈化設備有限公司；HH型恒溫水浴鍋:金壇市金城國勝實驗儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 益生菌發酵青稞飲料工藝流程

1.3.2 操作要點

接種:將試驗所需的器材在0.1MPa(121～126℃)條件下滅菌15min；取青稞酶解液,用10%的碳酸鈉溶液調節pH,每組分裝50 mL后在沸水浴中殺菌10 min,冷卻至40℃左右,在無菌操作臺上接種直投式益生菌發酵劑,振蕩均勻。

恒溫發酵:按照單因素試驗設計的方案,將接種后的青稞酶解液置于恒溫培養箱中,發酵一定時間后,測定發酵液的酸度。

調配:按照本實驗室研究得出的工藝配方,加入蔗糖進行調味,并加入復配穩定劑得到成品[13]。

1.3.3 試驗設計

(1)單因素試驗設計

試驗選取發酵時間(8h、16h、24h、32h、40h、48h、56h、64 h、72 h、80 h、88 h)、發酵起始pH(6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)、接種量(3.5%、4.0%、4.5%、5.0%、5.5%)、發酵溫度(36℃、38℃、40℃、42℃、44℃)等因素分別進行試驗,以探討其對發酵液酸度的影響。

(2)響應面優化試驗設計

在單因素試驗的基礎上,根據中心組合試驗設計(centralcomposite design,CCD)原理,以發酵液酸度為響應值,使用Design-Expert8.0.5軟件,選取發酵溫度(A)、發酵起始pH值(B)及接種量(C)為自變量,采用3因素3水平的響應面法對試驗結果進行優化,以確定最佳的發酵工藝條件[14-15]。試驗因素與水平見表1。

表1 飲料發酵工藝優化響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments for beverage fermentation technology optimization

1.3.4 檢測方法

酸度的測定:電位滴定法[16]；pH值的測定:酸度計法[17]；還原糖含量的測定:直接滴定法[18]；氨基酸含量的測定:甲醛滴定法[18]。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 發酵時間的確定

發酵時間的長短直接影響益生菌發酵生成乳酸的量以及發酵的完全程度。在發酵起始pH 7.0,接種量4.5%,發酵溫度40℃的條件下,探討了不同發酵時間對發酵液酸度的影響,其結果見圖1。

圖1 發酵時間對發酵液酸度的影響Fig.1 Effect of fermentation time on the acidity of fermentation broth

由圖1可知,發酵液的酸度隨著發酵時間的增加而增大,當達到72 h后,雖然酸度有所增加,但增幅不大,基本趨于穩定,故確定最適發酵時間為72 h,此時發酵液的酸度達到64.6°T。

2.1.2 發酵起始pH的確定

益生菌的生長需要特定的pH來維系細胞內各種生物活性分子的結構穩定,同時胞內酶也需要一個最適的pH值來維持其活性[19]。益生菌生長pH范圍一般為5.0～7.5,且隨著發酵的進行,pH值不斷降低,將對益生菌的生長更加不利[20],因此需要確定一個起始pH使益生菌更好地生長和發酵。在接種量4.5%,發酵溫度40℃,發酵時間72 h的條件下,探討了不同發酵起始pH對發酵液酸度的影響,其結果見圖2。

圖2 發酵起始pH對發酵液酸度的影響Fig.2 Effect of initial pH on acidity of fermentation broth

由圖2可知,在其他發酵條件一定的情況下,起始pH在6.0～7.0時發酵液的酸度隨著起始pH值的增加而呈現上升趨勢,當起始pH在7.0～8.0時發酵液的酸度隨著起始pH值的增加而減小,在起始pH值為7.0時發酵液酸度達到最大(65.0°T)。當環境偏酸或偏堿,使益生菌內酶的活力降低,生長能力變弱,產酸的能力也就變弱[20],因此確定pH值7.0為益生菌生長的最適發酵起始pH。

2.1.3 接種量的確定

接種量大小不僅直接影響到益生菌發酵青稞飲料的發酵速率,而且對最終產品的風味也會產生決定性的影響[21]。在發酵起始pH 7.0,發酵溫度40℃,發酵時間72 h的條件下,探討了不同接種量對益生菌發酵液酸度的影響,其結果見圖3。

圖3 接種量對發酵液酸度的影響Fig.3 Effect of inoculum on acidity of fermentation broth

由圖3可知,在其他發酵條件一定的情況下,當接種量在3.5%～4.5%時,發酵液酸度隨著接種量的增大而增大,當接種量在4.5%～5.0%時,發酵液酸度隨著接種量的增大而減小,接種量繼續增加到5.5%時,發酵液酸度不再變化,在接種量為4.5%時發酵液酸度達到最大值(63.0°T)。此時底物濃度與益生菌的比例達到最佳,發酵酸度達到最大；當接種量低于或高于4.5%時,均會影響乳酸的生成。因此確定4.5%為最適接種量。

2.1.4 發酵溫度的確定

發酵溫度影響到益生菌的生長進而影響發酵的速度和乳酸的積累。在發酵起始pH7.0,接種量4.5%,發酵時間72 h的條件下,探討了不同發酵溫度對益生菌發酵液酸度的影響,其結果見圖4。

圖4 發酵溫度對發酵液酸度影響Fig.4 Effect of fermentation temperature on the acidity of fermentation broth

由圖4可知,在其他發酵條件一定的情況下,發酵溫度在36～40℃時,發酵液的酸度隨著發酵溫度的升高而增大,當發酵溫度在40～44℃時,發酵液的酸度隨著發酵溫度的升高反而減小,當發酵溫度為40℃時,酸度達到最大(66.0°T)。發酵溫度過低或過高均會抑制益生菌的生長,從而產酸能力降低,產酸量也就小。因此確定40℃為最適發酵溫度。

2.2 響應面優化試驗

2.2.1 響應面方案設計與結果

根據中心組合試驗設計(centralcompositedesign,CCD)原理,綜合單因素試驗結果,使用Design-Expert8.0.5軟件,選取發酵溫度(A)、發酵起始pH值(B)、接種量(C)為自變量,以發酵液酸度(Y)為響應值,設計了3因素3水平的響應面試驗組,響應面試驗結果見表2,方差分析見表3。

表2 飲料發酵工藝優化響應面試驗設計與結果Table 2 Design and results of response surface experiments for beverage fermentation technology optimization

用Design-Expert 8.0.5軟件對試驗數據進行多元回歸擬合,得到試驗因素對酸度的回歸方程如下:

由表3可知,該模型的F值87.65,P＜0.000 1,回歸模型極其顯著；A、B、C、A2、B2、C2對酸度影響極顯著(P＜0.01),AB、AC、BC對產酸的交互效應影響分別是極顯著(P＜0.01)、顯著(P＜0.05)和不顯著(P＞0.05)。失擬項P=0.1238＞0.05不顯著,說明該模型與純誤差關聯不顯著,該方案可用于實際生產。根據表3擬合回歸方程的復相關系數R2為0.987 5,說明該模型擬合程度很好,誤差小,試驗條件的選擇適宜。

2.2.2 響應面結果分析及最佳工藝驗證

采用Design-Expert8.0.5軟件獲得三維響應面和等高線圖,能夠直觀地反映出各因素及其相互作用對試驗結果的影響,結果見圖5。

由圖5a可知,發酵溫度(A)對酸度的影響要大于接種量(C)對酸度的影響；等高線圖中橢圓度較大,說明AC兩因素之間交互影響顯著(P＜0.05)；由圖5b可知,發酵起始pH值(B)對酸度的影響比發酵溫度(A)更明顯(P＜0.01)；等高線圖中橢圓度很大,說明AB兩因素之間交互影響極顯著；由圖5c可知,發酵起始pH值(B)比接種量(C)的對酸度的影響大；等高線圖的橢圓度的較小,說明BC兩因素之間交互作用不顯著(P＞0.05)。

經Design-Expert8.0.5軟件優化處理后,得到益生菌發酵青稞發酵飲料的最佳工藝條件為:發酵溫度41.05℃,發酵起始pH值7.25,接種量4.69%。將響應面優化方案修約后的工藝條件進行3組平行試驗即:在發酵起始pH值7.3,接種量4.7%,發酵溫度41℃,發酵時間72 h,3個試驗組發酵液酸度的平均值可以達到68.67°T,與理論預測值69.21°T的相對誤差為0.79%,與試驗結果相符。

圖5 發酵溫度、接種量和發酵起始pH交互作用對發酵液酸度影響的響應面與等高線Fig.5 Response surface plots and contour line of effects of interaction between fermentation temperature,inoculum and fermentation initial pH on the acidity of fermentation broth

3 結論

本研究以青稞酶解液為原料,采用響應面法對益生菌發酵青稞飲料的工藝條件進行了優化,結果表明,3個因素對產酸的影響順序為發酵起始pH值＞發酵溫度＞接種量；3個因素兩兩間的交互作用對產酸的影響分別是:發酵溫度與發酵起始pH值極顯著(P＜0.01),發酵溫度與接種量顯著(P＜0.05),發酵起始pH與接種量不顯著(P＞0.05)。益生菌發酵青稞飲料的最佳工藝條件為:發酵起始pH值7.3,直投式益生菌發酵劑(保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌)接種量4.7%,發酵溫度41℃,發酵時間72 h,發酵液的酸度可達到68.67°T。發酵液經加入蔗糖和復配穩定劑調制后,得到顏色呈乳白色,性狀穩定,口感宜人,且含有活菌的益生菌發酵青稞飲料,是一款營養豐富、品質優良的保健飲料。

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