復合酶法結合液相色譜技術測定山藥酒中薯蕷皂苷的含量

王晨慧,饒 靜,2,辛 鵬,2,李春揚,2,張曉磊,2*,尹建軍,2,宋全厚,2

(1.中國食品發酵工業研究院,北京 100015；2.國家食品質量監督檢驗中心,北京 100015)

山藥是一種藥食同源的保健佳蔬,具有獨特的藥用和保健價值[1]。隨著人們對保健和功能性食品需求的不斷上升,以山藥為原料,經現代生物技術手段發酵而成的山藥酒,不僅可以最大程度的保留山藥中的活性成分,還可通過微生物的代謝合成多種有益物質,越來越受到消費者的青睞。近年來,食品中的活性功能成分日益受到關注,已成為熱門的研究課題,薯蕷皂苷作為山藥特有的活性成分,具有明顯的抗腫瘤作用[2],在治療心血管疾病、腦炎、皮膚病方面也有顯著效果[3],其研究多集中于山藥或其他制品[4-5],在山藥酒中則未見報道,檢測技術的缺失,極易導致對活性功能成分的過分夸大,影響行業健康有序的發展,因此,本研究旨在建立山藥酒中薯蕷皂苷的檢測技術,并對市售山藥酒中薯蕷皂苷含量進行分析比較,以填補資料空白,為提高產品品質、促進行業科技進步與良性健康發展提供有力的技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

6種山藥酒樣品(1種發酵原酒、4種山藥發酵酒和1種以山藥為原料的黃酒,品牌A、品牌B,分別編號為1#、2#、3#、4#、5#、6#):市售。

三氯甲烷、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀(均為分析純)、鹽酸(純度≥98%):北京化工廠；纖維素酶(100 U/mg)、淀粉酶(50 U/mg)、甲醇、乙腈(均為色譜純)、薯蕷皂苷對照品(純度≥98%):上海安譜實驗科技股份有限公司。

1.2 儀器與設備

Waters高效液相色譜儀(high performance liquid chromatograph,HPLC)(配有2487UVD紫外檢測器):美國Waters公司；Milli-Q Reference超純水發生器:美國Millipore公司；AL204-IC萬分之一天平:梅特勒-托利多儀器上海有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酶解液制備

取200 mL山藥酒于蒸發皿中,蒸發濃縮至5 mL左右,置于磷酸緩沖溶液中,加入一定量的酶(酶用量按濃縮前山藥酒取樣量計算),在一定溫度條件下酶解一段時間,加入100 mL的5%鹽酸-甲醇溶液(1∶1,V/V),沸水浴條件下回流5 h,冷卻至室溫后,調節pH=8,在55℃條件下旋蒸至30 mL,用50 mL三氯甲烷萃取3次,萃取后的有機相旋蒸近干,用2 mL甲醇溶解,過膜于色譜瓶中待測。

1.3.2 單因素試驗優化山藥酒酶解液制備工藝

量取200 mL山藥酒于蒸發皿中,蒸發濃縮后,置于磷酸緩沖溶液中,分別考察酶的種類(淀粉酶、纖維素酶、復合酶(纖維素酶∶淀粉酶酶活力比=1∶1))、酶用量(0.5 U/mL、1 U/mL、2 U/mL、3 U/mL、4 U/mL)、酶解初始pH值(2.5、5.0、5.8、6.8、7.8)、酶解時間(3 h、6 h、12 h、24 h、48 h)、酶解溫度(35℃、40℃、45℃、50℃、55℃)等因素對山藥酒中薯蕷皂苷含量的影響。

1.3.3 正交試驗優化山藥酒酶解液制備工藝

在單因素試驗的基礎上,以薯蕷皂苷含量為考察指標,利用L9(34)正交試驗分別考察復合酶用量(A)、酶解時間(B)、酶解溫度(C)、酶初始pH值(D)對薯蕷皂苷含量的影響。正交試驗因素與水平見表1。

表1 山藥酒酶解條件優化正交試驗因素與水平Table1 Factors and levels of orthogonal experiments for enzymolysis conditions of yam wine

1.3.4 測定方法

采用高效液相色譜法測定薯蕷皂苷含量。色譜條件[6-10]為InertsilRODS-3色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流動相:乙腈-水(50∶50,V/V)；流速:1.0 mL/min；紫外檢測波長:203 nm；柱溫:30℃；進樣量:10 μL。

標準曲線的繪制:準確配制質量濃度為1 g/L薯蕷皂苷標準儲備液,再用甲醇分別配制成5mg/L、10mg/L、25mg/L、50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L的薯蕷皂苷標準工作液。以薯蕷皂苷的峰面積(y)為縱坐標,質量濃度(x)為橫坐標繪制標準曲線,經線性回歸,回歸方程為:y=2979.9x-11600；相關系數R為0.998 9,表明薯蕷皂苷在4.91～196.40 mg/L范圍內線性關系良好。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 酶種類的選擇

薯蕷皂苷在植物體內多與糖以糖苷鍵的形式結合成甙,強酸和酶都可以破壞薯蕷皂甙的糖苷鍵,有利于薯蕷皂苷的分離。目前,薯蕷皂苷的提取方法主要有直接酸解法[11]、超聲提取法[12]、回流提取法[6]和酶解法[13-15],而酶解法可采用溫和的方式有效降解糖苷鍵,對薯蕷皂苷的提取效果優于超聲提取法和回流提取法。本研究采用淀粉酶、纖維素酶和復合酶解法(纖維素酶∶淀粉酶酶活力比=1∶1)進行提取,以薯蕷皂苷的含量為指標,確定山藥酒中薯蕷皂苷的最佳提取方法,試驗結果如圖1。

圖1 單一酶解法與復合酶解法試驗結果比較Fig.1 Comparison of experimental results of single and complex enzyme methods

由圖1可知,復合酶解法提取薯蕷皂苷的效果優于單一酶解法,且采用復合酶解法得到的皂苷含量為1.147 mg/L,因此,選擇復合酶解法進行樣品提取。

2.1.2 復合酶用量對薯蕷皂苷含量的影響

圖2 復合酶用量對薯蕷皂苷含量的影響Fig.2 Effect of complex enzyme addition on the content of diosgenin

由圖2可知,薯蕷皂苷的含量隨復合酶用量的增加呈先增加后趨于平緩的趨勢,當復合酶用量為2 U/mL時,薯蕷皂苷的含量最大,為1.143 mg/L,繼續增加酶用量,薯蕷皂苷含量略有下降。這可能與酶量增加到一定程度時,酶分子過于飽和,一部分酶不能與底物結合,使得水解速度變慢,從而導致薯蕷皂苷濃度降低相關。因此選擇復合酶用量為2 U/mL進行后續試驗。

2.1.3 酶解初始pH值對薯蕷皂苷含量的影響

由圖3可知,薯蕷皂苷的含量隨酶解初始pH值的升高呈先增加后減少的趨勢,當酶解初始pH值為5.0時有利于復合酶發揮最大活力,薯蕷皂苷的含量最高,繼續升高pH值,薯蕷皂苷含量開始減少。過高或過低都不利于酶解作用,浸提效率降低。因此選擇酶解初始pH值為5.0進行后續試驗。

圖3 酶解初始pH值對薯蕷皂苷含量的影響Fig.3 Effect of enzymolysis initial pH on the content of diosgenin

2.1.4 酶解時間對薯蕷皂苷含量的影響

圖4 酶解時間對薯蕷皂苷含量的影響Fig.4 Effect of enzymolysis time on the content of diosgenin

由圖4可知,薯蕷皂苷含量隨著酶解時間的延長呈先增加后緩慢減少的趨勢,當酶解時間為9 h時,薯蕷皂苷含量達到最大值。繼續延長酶解時間,薯蕷皂苷含量反而下降,這可能由于發酵時間過長,薯蕷皂苷本身結構進一步分解,從而影響酸解后薯蕷皂苷含量的測定。因此選擇酶解時間為9 h進行后續試驗。

2.1.5 酶解溫度對薯蕷皂苷含量的影響

圖5 酶解溫度對薯蕷皂苷含量的影響Fig.5 Effect of enzymolysis temperature on the content of diosgenin

由圖5可知,薯蕷皂苷含量隨著酶解溫度的升高呈先增加后減少的趨勢,當酶解溫度為45℃時,薯蕷皂苷含量最高,達到1.145 mg/L,然而繼續升高酶解溫度時,薯蕷皂苷含量開始下降。這可能由于溫度過高導致復合酶部分失活或影響了其協同作用,從而影響山藥酒中薯蕷皂苷的提取效率。因此選擇酶解溫度為45℃進行后續試驗。

2.2 正交試驗結果

在單因素試驗的基礎上,通過L9(34)正交試驗確定最佳條件,正交試驗結果與分析見表2。

表2 山藥酒酶解條件優化正交試驗結果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for enzymolysis conditions of yam wine

由表2可知,根據R值對酶解影響因素排序為復合酶用量＞酶解初始pH值＞酶解時間＞酶解溫度,根據正交試驗極差分析確定最優條件為A2B3C1D2,即復合酶用量為2U/mL,酶解時間為12 h,酶解溫度為40℃,酶解初始pH值為5.0。在此條件下,薯蕷皂苷含量為1.158 mg/L。

2.3 樣品測定結果

采用上述方法對市售2個品牌的6種山藥酒中薯蕷皂苷的含量進行測定,結果見表3。對照品及典型樣品高效液相色譜分析圖譜見圖6。

表3 市售山藥酒中薯蕷皂苷含量的測定結果Table 3 Determination results of diosgenin content in commercial yam wine

由表3可知,6種樣品中薯蕷皂苷含量范圍為0.106～1.156 mg/L。山藥發酵原酒(1#)中薯蕷皂苷含量最高,為1.156 mg/L；4種山藥發酵酒(2#、3#、4#、5#)薯蕷皂苷含量均低于以山藥為原料的黃酒(6#)；品牌A的3種山藥發酵酒(2#、3#、4#)中薯蕷皂苷含量接近,品質較為穩定。上述結果為深入研究山藥酒中薯蕷皂苷及其他活性功能成分提供了有價值的數據參考。

圖7 對照品(A)及典型樣品(B)高效液相色譜色譜圖Fig.7 Chromatography of reference substances(A)typical samples(B)analysis by HPLC

3 結論

本研究確立復合酶法結合液相色譜測定山藥酒中薯蕷皂苷的方法,酶解條件為復合酶用量為2U/mL,酶解時間為12 h,酶解溫度為40℃,酶解初始pH值為5.0。采用InertsilRODS-3色譜柱(250 nm×250 nm,5 μm)；流動相為乙腈-水(50∶50,V/V)；流速1.0mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長203 nm。采用這一技術對市售2種品牌6種山藥酒產品進行測定,薯蕷皂苷含量范圍為0.106～1.156 mg/L。本研究所建立的方法簡便、準確、可靠,適用于山藥酒中活性功能成分薯蕷皂苷的檢測,可為提高產品品質提供有力的數據支撐和技術手段。

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