自然發酵肉制品中乳酸菌的體外降膽固醇特性

云月英,馬宇南,王文龍

(1.內蒙古科技大學 生命科學與技術學院,內蒙古 包頭 014010；2.內蒙古科技大學 后勤處,內蒙古 包頭 014010)

膽固醇在人體內具有重要的生理作用,但血清膽固醇水平過高會增加心血管疾病的患病風險[1-2]。近年來,隨著國民生活方式和膳食結構類型的轉變,我國居民心血管疾病的患病率持續上升,對人體健康造成了巨大的影響,成為城鄉居民死亡的首要原因[3]。據報道,血清膽固醇水平下降1%,冠心病的患病風險可降低2%～3%[4]。所以,選擇恰當的方法降低膳食及血清中膽固醇的水平尤為重要。

利用微生物降膽固醇因具有高效、低成本、安全性高等特點,受到研究者的廣泛關注[5]。乳酸菌是發酵肉制品生產中最常用的發酵劑,研究表明其中的一些菌株具有高效降膽固醇的能力,如植物乳桿菌[6-7]、戊糖片球菌[8]、消化乳桿菌[9]等。目前認為,乳酸菌主要通過共沉淀作用、菌體對膽固醇的同化吸收作用以及兩者協同作用等方式來發揮其降膽固醇的功效[10]。因此,選育具有降低膽固醇能力的乳酸菌菌株,并對其機制進行研究,對于乳酸菌在功能性發酵肉制品中的應用具有重要的意義[11]。

本研究通過鄰苯二甲醛法測定膽固醇的含量,對來源于自然發酵肉制品中的乳酸菌的體外降膽固醇特性進行初步研究,篩選出降膽固醇性能優良的菌株并進行鑒定,為功能性肉制品發酵劑的開發提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株:從自然發酵肉制品中分離篩選[12],編號為M5、M6、M7、M8、M9、M12、M14、M15、M16、M18、M21、M23、M24。

鄰苯二甲醛、蔗糖脂肪酸酯:北京索萊寶科技有限公司；牛膽鹽:天津風船化學試劑科技有限公司；膽固醇:美國Sigma公司。所有試劑均為分析純。

MRS肉湯培養基:廣東環凱微生物科技有限公司。

高膽固醇MRS液體培養基:膽固醇0.1 g,蔗糖脂肪酸酯0.1 g,牛膽鹽0.2 g,1 mL吐溫-80,置于小燒杯中,攪拌均勻,加入5 mL冰乙酸,60℃水浴中溶解,超聲波間歇處理15 min,快速加入1 000 mL MRS肉湯培養基中,即為含0.1 mg/mL膽固醇膠束的高膽固醇MRS液體培養基[13]。

1.2 儀器與設備

PSX智能型恒溫恒濕培養箱:寧波萊福科技有限公司；SW-CJ-2FD潔凈工作臺:上海博訊實業有限公司醫療設備廠；F200顯微鏡:上海長方光學儀器廠；R20BC臺式高速冷凍離心機:湖南凱達科學儀器有限公司；YXQ-LS-30SII立式壓力滅菌器:上海東亞壓力容器制造有限公司；JA5003電子分析天平:上海超平科技儀器有限公司；UV-7504單光束-可見分光光度計:上海欣茂儀器有限公司；JY92-IIN超聲波細胞粉碎機:寧波新芝生物科技股份有限公司；CX-AG050厭氧罐:上海川翔生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 降膽固醇乳酸菌的初篩

供試菌液按4%(V/V)的接種量接種于高膽固醇MRS液體培養基中,37℃厭氧培養24h,離心(12000r/min、4℃、10 min),測定上清液中膽固醇的含量,以未接菌的高膽固醇MRS液體培養基為對照,計算膽固醇去除率[14]。

1.3.2 菌體的同化吸收及共沉淀試驗

供試菌液按4%(V/V)的接種量接種于高膽固醇MRS液體培養基中,37℃厭氧培養24h,離心(12000r/min、4℃、10min),取上清液；傾出剩余上清液,加入0.1mol/L、pH7.0的Na2HPO4/NaH2PO4緩沖液5 mL,混勻后離心(12 000 r/min、4℃、10 min),取上清液為菌體洗滌液；傾出剩余菌體洗滌液,再加入0.1mol/L、pH7.0的Na2HPO4/NaH2PO4緩沖液5mL,于冰浴條件下超聲波破碎細胞,離心(12 000 r/min、4℃、10min),取上清液為菌體破碎液。以未接種的高膽固醇MRS液體培養基為對照,分別測定上清液、洗滌液和破碎液中的膽固醇含量[14]。

1.3.3 膽鹽對菌體降膽固醇能力的影響

將上述高膽固醇MRS液體培養基中牛膽鹽的添加量調整為0、3g,其他成分不變,即得膽鹽質量濃度為0、0.3g/100mL的高膽固醇MRS液體培養基。供試菌液按4%(V/V)的接種量分別接種于這兩種培養基中,37℃厭氧培養24 h,離心(12 000 r/min、4℃、10 min),測定上清液中膽固醇含量,以未接菌的高膽固醇MRS液體培養基為對照,計算膽固醇去除率[15]。

1.3.4 菌體細胞對超聲波的抗性

供試菌液按4%(V/V)的接種量分別接種于MRS液體培養基、膽鹽質量濃度為0和0.3 g/100 mL的高膽固醇MRS液體培養基中,37℃厭氧培養24h,離心(12000r/min、4℃、10 min),收集菌體,用5 mL無菌生理鹽水懸浮,菌懸液置于冰浴條件下進行超聲破碎,取破碎前后的菌懸液,采用平板計數法,計算菌體存活率[16]。

1.3.5 熱滅活細胞和休眠細胞的降膽固醇作用

取等量供試菌液,一份121℃滅菌15 min,離心(12 000 r/min、4℃、10 min),收集菌體,然后加入5 mL高膽固醇MRS液體培養基；另一份同樣條件下離心,菌體重懸浮于5 mL含相同濃度膽固醇膠束的0.05 mol/L,pH 6.8的磷酸鹽緩沖液中。空白不接種菌體,37℃厭氧培養24 h,離心(12 000 r/min、4℃、10 min),測定上清液中膽固醇含量,計算膽固醇去除率[17]。

1.3.6 16S rRNA分子生物學鑒定

采用Axygen細菌基因組DNA小量制備試劑盒提取細菌基因組DNA。以細菌基因組DNA為模版,用通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′)進行16S rRNA基因序列擴增。聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)條件:95℃、5 min；95℃、30 s,58℃、30 s,72℃、90 s,35個循環；72℃、7 min。PCR產物經凝膠電泳分析后送上海派森諾生物科技股份有限公司測序,測序結果在NCBI基因庫中進行BLAST同源性分析。

1.3.7 測定方法

膽固醇含量的測定:根據參考文獻[18]的方法進行測定,其計算公式如下:

式中:C0為未接種菌株培養基中膽固醇含量,μg/mL；C1為實驗菌株發酵上清液中膽固醇含量,μg/mL。

式中:N0為超聲波破碎前菌懸液的活菌數,CFU/mL；N1為超聲波破碎后菌懸液的活菌數,CFU/mL。

2 結果與分析

2.1 降膽固醇乳酸菌初篩結果

待測菌株對培養基中膽固醇的去除率如表1所示。

表1 乳酸菌降膽固醇能力Table 1 Cholesterol-degrading capability of lactic acid bacteria

由表1可知,不同菌株的降膽固醇能力有很大的差異,膽固醇去除率為4.70%～49.11%,其中菌株M12、M18、M21和M23的去除率＞40%。乳酸菌對胃腸道的耐受性是其發揮生理功能的關鍵因素[19]。菌株耐受性實驗表明,菌株M12和M23分別在pH值為3.0的MRS液體培養基、含0.3g/100mL膽鹽的MRS液體培養基以及人工模擬胃腸道環境中顯示出較好的耐受性,而M18和M21的耐受性較差。綜合以上結果,選擇菌株M12和M23為目標菌株,對其降膽固醇的機理進行初步的探討。

2.2 菌體的同化吸收及共沉淀試驗

圖1 菌株M12、M23培養液各部分的膽固醇含量Fig.1 Cholesterol contents in all parts of culture solution of strains M12 and M23

由圖1可知,原培養液中23.20%和30.10%的膽固醇存在于受試菌體的洗滌液中,25.26%和19.40%的膽固醇存在于菌體破碎液中。菌體洗滌液中的膽固醇主要來自膽鹽與膽固醇的共沉淀,破碎液中的膽固醇主要來自菌體細胞對膽固醇的同化吸收。因此,這兩株菌都是依靠同化吸收作用與膽鹽共沉淀作用協同來降低培養基中的膽固醇含量,且菌株M23的共沉淀作用高于同化吸收作用。

2.3 膽鹽對菌體降膽固醇能力的影響

圖2 牛膽鹽對菌株M12、M23降膽固醇能力的影響Fig.2 Effect of bile salt on cholesterol-degrading capability of strains M12 and M23

研究表明[20-21],添加一定量的膽鹽可與膽固醇發生共沉淀作用,同時還可以增加菌體細胞的通透性,利于其對膽固醇的吸收,從而提高菌體細胞的降膽固醇能力。通常認為人體腸道膽鹽濃度平均為0.3g/100mL[22]。因此,在培養基中添加0.3 g/100 mL的牛膽鹽研究其對菌體去除膽固醇能力的影響。由圖2可知,在不添加膽鹽時,菌株M12和M23的膽固醇去除率僅為18.29%和20.36%；當添加0.3 g/100 mL的牛膽鹽時,菌株對膽固醇的去除能力顯著升高(P＜0.01),去除率分別為56.05%和58.49%。

2.4 菌體對超聲波的抗性

圖3 菌株M12、M23對超聲波的抗性Fig.3 Resistance of strains M12 and M23 to ultrasonic wave

由圖3可知,菌株M12和M23在3種培養基中對超聲波的耐受性有明顯的差異(P＜0.05),在未添加膽固醇的培養基中存活率僅為18.00%和22.22%,在加入膽固醇的培養基中存活率提高為22.45%和27.21%,這可能與菌體細胞吸收膽固醇,增強細胞膜的抗性有關[23]。在同時添加膽固醇和牛膽鹽的培養基中菌株的存活率進一步提高,可達到32.09%和37.93%,可能是因為添加膽鹽可增強菌體對膽固醇的吸收,從而使細胞膜的抗性更強,這與上述實驗中添加膽鹽提高了菌體對膽固醇的去除能力結果相符。

2.5 熱滅活菌體和休眠菌體的降膽固醇作用

表2 熱滅活菌體和休眠菌體的降膽固醇作用Table 2 Cholesterol-degrading capability of the thermal inactivated cells and dormant cells

由表2可知,菌株M12和M23的休眠菌體對膽固醇的去除率較高,雖然與上述活菌體相比有一定的下降,但仍可達到30%以上。熱滅活菌體也具有一定的去除膽固醇的能力,但去除率較低,僅為10%左右。以上結果表明菌體細胞的降膽固醇作用與其生長狀態有關,菌體細胞生長越旺盛,降膽固醇能力越強,這與劉長建等[24]報道的結論一致。

2.6 菌株16S rRNA序列分析

圖4 菌株M12、M23的PCR產物電泳圖Fig.4 Electrophoretograms of PCR products of strains M12 and M23

由圖4所示,對菌株M12、M23的PCR產物進行電泳分析,得到大小約為1 500 bp的特異性擴增產物,測序片段長度分別為1 496 bp、1 509 bp,符合16S rRNA序列長度。將獲得的序列在NCBI上進行BLAST同源性分析,這2株菌分別與彎曲乳桿菌(Lactobacillus curvatus)和戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)有99%的同源性。因此確定菌株M12為彎曲乳桿菌(Lactobacillus curvatus),菌株M23為戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)。

3 結論

對自然發酵肉制品中分離出的13株乳酸菌的體外降膽固醇能力進行了測定,結果顯示其去除率差別較大,為4.70%～49.11%。選擇其中膽固醇去除率較高且耐受性較好的2株菌作為目標菌株,進一步探討其降膽固醇的作用機理。通過研究發現,2株菌的降膽固醇機制為同化吸收和共沉淀協同作用；添加0.3 g/100 mL膽鹽可顯著增加菌體對膽固醇的去除作用(P＜0.01),去除率分別為56.05%和58.49%；添加膽固醇和膽鹽均可顯著提高菌株經超聲波處理后的存活率(P＜0.05),存活率分別為32.09%和37.93%；2株菌的熱滅活菌體和休眠菌體也具有一定的膽固醇去除能力,且休眠菌體的去除率高于熱滅活菌體。經16SrRNA序列分析,菌株M12為彎曲乳桿菌(Lactobacillus curvatus),菌株M23為戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)。對于菌株M12和M23的降膽固醇影響因素、體內降膽固醇能力及作為發酵劑在肉制品中的應用等問題,仍需進一步研究。

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