小麥條銹菌效應蛋白原核表達、純化及其溶解性研究

趙海斌，王媛媛，陶 虎

(1.西北農林科技大學 化學與藥學院；2.西北農林科技大學 生命科學學院，陜西楊凌 712100)

由專性寄生型真菌條形柄銹菌(Pucciniastriiformisf. sp.tritic,Pst)引起的小麥條銹病是一種氣傳病害，不僅是一種重要的世界性病害，也是長期影響中國小麥安全生產的嚴重生物災害，一般流行年份可以造成約10%～30%產量損失，即年均約1億人的口糧損失，特大流行年份減產可達60%以上，甚至使小麥顆粒無收。作為活體營養型的銹菌在侵害寄主的過程中，形成與寄主細胞有著非常緊密聯系的唯一侵染結構——吸器。病原銹菌可以通過吸器從寄主細胞獲取營養物質[1]，同時通過吸器向寄主細胞分泌大量的效應蛋白以抑制寄主的防御反應，這對銹菌的成功入侵至關重要。Voegele研究小組克隆鑒定青豆銹菌吸器分泌蛋白RTP1，是首例被證明在植病親和互作中于吸器特異表達，然后轉移到寄主細胞內的效應蛋白[2]。亞麻銹菌的AvrM和AvrL567效應蛋白在病原菌侵染的過程中也從吸器被轉運到寄主的細胞中，并且AvrM和AvrL567在不依賴病原菌轉運系統的情況下也能夠進入寄主細胞，它們的跨膜轉運依賴于其N端的轉運信號，說明它們的轉運可能是利用寄主細胞的轉運機制[3]。

雖然現有研究已經表明吸器與寄主細胞之間存在大量分子轉運，但目前對絕大多數效應蛋白的轉運機制和致病機理仍不清楚。雖然在AvrL567氨基酸序列上找不到任何同源的結構域信息，但根據三維結構的拓撲學相似性在PDB數據庫中找到一個可能具有同樣功能的小麥褐斑病菌的毒素蛋白ToxA。而ToxA具有一個Arg-Gly-Asp結構域，可以被寄主細胞膜上的類似整合素樣受體識別，經過胞吞作用進入寄主細胞，這個結果暗示AvrL567可能的轉運機制[4]。對AvrM的結構研究揭示它能形成一個二聚體蛋白且具有一小塊保守的疏水表面，可以跟質膜結合，對于該蛋白為什么在不依賴病原轉運系統的時候也能進入寄主細胞有了更深的認識[5]。而這兩項研究充分說明蛋白質結構生物學是開展效應蛋白功能深入研究的重要手段，為揭示效應蛋白的轉運機制奠定基礎，對解析銹菌的致病機理具有重要意義。

目前，可以使用蛋白質結構生物學方法來解析效應蛋白的結構，通過比對已有的蛋白質結構數據庫(Protein Data Bank)，找到相似的結構域，來推理效應蛋白的功能，之后通過生化方面的方法來驗證[6]。本文初步對3個小麥條銹菌效應蛋白進行原核表達、純化以及溶解性研究，為核磁共振法或X-射線晶體衍射法解析其蛋白質結構[7]和研究小麥條銹菌侵染機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

表達載體pET-22b(+)、pET-32a-pp (+)、大腸桿菌菌株Turbo、BL21(DE3)都由西北農林科技大學化學與藥學院蛋白質三維結構實驗室保存并改造；效應蛋白模板由西北農林科技大學康振生教授饋贈；Taq酶、PCR Mix、限制性內切酶(NdeⅠ、NcoⅠ和XhoⅠ)、TA克隆試劑盒、T4DNA連接酶均購于寶生物工程 (大連) 有限公司；DNA Marker(DM2000)、質粒抽提試劑盒、DNA膠回收試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒均由北京康為世紀生物科技有限公司提供；蛋白質Marker購于Thermo Fisher Scientific公司；Ni-NTA agarose柱購自美國GE公司；HPLC 的型號FL2200購買于浙江福利分析儀器有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 方 法

1.2.1 原核表達載體的構建與鑒定[8]以康振生教授饋贈的質粒為模板，進行PCR擴增獲得目的基因 pst-1178、 pst-1374和 pst-8713，并進行TA克隆。使用NdeⅠ和XhoⅠ位點，分別將 pst-1178、 pst-8713與載體pET-22b進行重組，獲得重組表達載體pET-22b- pst-1178、pET-22b- pst-8713。使用NcoⅠ和XhoⅠ位點，將 pst-1374與載體pET-32a-pp進行重組，獲得重組表達載體pET-32a-pp- pst-1374。將測序正確的表達載體轉化BL21(DE3)。

1.2.2 目的蛋白的誘導表達[9]挑取含有重組質粒的BL21單克隆過夜擴大培養，以體積比1∶500 轉接至1 L含100 mg Amp的液體LB培養基，37 ℃培養至OD600約0.6～0.8，待培養基冷卻至室溫后，加入終濃度1 mmol/L的異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)。pET-22b- pst-8713、pET-32a-pp- pst-1374是20 ℃誘導12 h；pET-22b- pst-1178為37 ℃誘導5 h。6 000 r/min，4 ℃ 離心5 min收集菌體后用磷酸鹽緩沖液(PBS,20 mmol/L KH2PO4,0.15 mol/L NaCl,pH 7.9)重懸，加入150 μg/mL的溶菌酶，1∶104(核酸酶與裂解液的體積比)核酸酶，1 mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)，混合均勻后冰浴30 min，每5 min混勻1次。超聲波破碎30 min (250 W，工作5 s，間歇5 s)后。12 000 r/min，4 ℃離心30 min。上清分離SDS-PAGE檢測，之后用0.22 μm的聚醚砜膜過濾后，備用。

1.2.3 蛋白質的純化 目的蛋白pst-1178和pst-8713的純化：首先用含10 mmol/L咪唑的Tris緩沖液(20 mmol/L Tris，0.15 mol/L NaCl，10 mmol/L 咪唑，pH 7.9)平衡鎳柱(Ni-NTA)，將上述得到的上清液以1 mL/min勻速上樣；然后用洗滌溶液(20 mmol/L Tris，0.15 mol/L NaCl，20 mmol/L 咪唑，pH 7.9)沖洗3～5柱體積，最后用洗脫溶液(20 mmol/L Tris，0.15 mol/L NaCl，0.250 mol/L 咪唑，pH 7.9)洗脫目的蛋白。之后測定洗脫的蛋白濃度，把配好的buffer A(φ=0.1% TFA)和buffer B(φ= 0.08% TFA，φ=70%乙腈)分別抽濾后，超聲除去氣泡。洗脫的目的蛋白先用0.22 μm濾膜過濾，在10 000 r/min離心2 min除去氣泡，用HPLC純化。經Tricine-SDS-PAGE檢測蛋白質純化效果，純化好的蛋白質樣品，用真空冷凍機凍干，得到干粉，-80 ℃保存。

目的蛋白pst-1374的純化：鎳柱純化方法與蛋白pst-1178和pst-8713一致，然后用洗脫得到的目的蛋白中以體積比1∶100加入自備的Prescission Protease酶[10](1 mg/mL)酶切并用1 L透析液(20 mmol/L Tris，0.15 mol/L NaCl，pH 7.9)透析12 h除去咪唑，降低鹽濃度。用buffer A (20 mmol/L Tris， pH 7.9)平衡HiTrap Q柱，將透析得到的蛋白液經0.22 nm的聚醚砜膜過濾后用AKTA蛋白純化系統以0.8 mL/min流速上柱，上完樣品后繼續以buffer A沖洗10～15 min，直至基線走平。然后以buffer A、buffer B(20 mmol/L Tris，1mol/L NaCl，pH 7.9)進行線性梯度洗脫，經Tricine-SDS-PAGE檢測蛋白質純化效果。給純化好的蛋白質樣品中加入1 mmol/L 苯甲脒和φ=0.02%的NaN3,液氮速凍后-80 ℃保存。

2 結果與分析

2.1 原核表達載體的構建與鑒定

從長有含重組表達質粒的3個Turbo平板上分別挑取單克隆搖菌并分別提取質粒做PCR檢測(圖1、圖2、圖3)條帶大小與理論值一致。并送其質粒至華大基因公司測序，結果與目的基因完全一致，表明表達載體pet-22b- pst-1178(圖1)、pet-32a-pp- pst-1374(圖2)和pet-22b- pst-8713(圖3)構建成功。

M. TaKara DL2000 marker；1～4.4個單克隆 PCR products of recombinant plasmids from four different monoclonal cells；5. 陰性對照 Negative control

圖1陽性重組質粒pET-22b-pst-1178的菌落PCR
Fig.1PCRproductsofpET-22b-pst-1178recombinantexpressionvectors

M.TaKara DL2000 marker；1. 陰性對照 Negative control； 2～3. 2個單克隆 PCR products of recombinant plasmids from two different monoclonal cells

圖2陽性重組質粒pET-32a-PP-pst-1374的菌落PCR
Fig.2PCRproductsofpET-32a-PP-pst-1374recombinantexpressionvectors

2.2 目的蛋白表達與純化

2.2.1 pst-1178的表達純化 將誘導表達的菌體破碎，離心后上清過鎳柱，將洗脫得到的融合蛋白經HPLC純化，獲得比較純的目的蛋白(圖4)。純化后蛋白條帶與理論值(13 ku)不一致，大約是理論值的3倍。根據其他試驗得出效應蛋白pst-1178是以多聚體形式存在于鹽溶液中。

2.2.2 pst-1374的表達純化 將誘導表達的菌體破碎，離心后上清過鎳柱，經Elution buffer洗脫得到的融合蛋白約27 ku，用Prescission Protease酶酶切后得到約10 ku蛋白和17.2 ku標簽蛋白。由于沒有酶切完全，所以圖中也有融合蛋白的條帶。經HiTrap Q純化后得到單一條帶的電泳純目的蛋白且分子質量與理論值一致(圖5、圖6)。

1～2.2個單克隆 PCR products of recombinant plasmids from two different monoclonal cells；3. 陰性對照 Negative control；M. TaKara DL2000 marker.

圖3陽性重組質粒pET-22b-pst-8713的菌落PCR
Fig.3PCRproductsofpET-22b-pst-8713recombinantexpressionvectors

1～4.蛋白表達的部分 The parts of expression;1.未誘導的大腸桿菌 The cell lysate before induction；2.IPTG誘導后 The cell lysate after induction；3.超聲波碎后的上清 The supernatant；4.離心后的沉淀 The supernatant and pellet of cell lysate；M.蛋白分子量標尺 Protein molecular weight marker (Thermo #26617)；5～8.鎳柱純化過程 The parts of nickel column purification；5.穿出 Flowthrough of supernatant of cell lysate during loading；6.10 mmol/L 咪唑的洗脫液 The wash of 10 mmol/L imidazole after loading；7、8.250 mmol/L 咪唑的洗脫液 Purification product eluted with 250 mmol/L imidazole lysis buffer；9.HPLC純化后的電泳純蛋白 Results of HPLC purification

圖4Tricine-SDS-PAGE分析pst-1178效應蛋白在大腸桿菌中的表達及純化過程
Fig.4ExpressionandpurificationofHis-taggedpst-1178onTricine-SDS-PAGE

2.2.3 pst-8713的表達純化 將誘導表達的菌體破碎，離心后上清過鎳柱，經洗脫得到融合蛋白，再經HPLC純化獲得比較純的目的蛋白，其分子質量與理論值(11 ku)一致(圖7)。

1～4. 蛋白表達的部分 The parts of expression；1.未誘導的大腸桿菌 The cell lysate before induction；2.IPTG誘導后 The cell lysate after induction；3.超聲波碎后的上清 The supernatant；4.離心后的沉淀 The pellet of cell lysate；5～8.鎳柱純化過程 The parts of nickel column purification；5.穿出液 Flowthrough of supernatant of cell lysate during loading；6.10 mmol/L 咪唑的洗脫液 The wash of 10 mmol/L imidazole after loading；7、8.250 mmol/L 咪唑的洗脫液 Purification product eluted with 250 mmol/L imidazole lysis buffer；M.蛋白分子量標尺 Protein molecular weight marker (Thermo #26611)

圖5Tricine-SDS-PAGE分析pst-1374效應蛋白在大腸桿菌中的表達及純化過程
Fig.5ExpressionandpurificationofHis-tagpst-1374onTricine-SDS-PAGE

M.蛋白分子標尺 Protein molecular weight marker (Thermo #26611)；1.Prescission protease酶 Prescission protease；2.酶切后的蛋白液 Effect of His-pst-1374 digested by prescission protease；3～5.第2次過鎳柱純化過程；3.穿出液 Loading flowt 10 mmol/L imidazole hrough of protease-digested product dialyzed in low imidazole buffer；4.10 mmol/L咪唑 10 mmol/L imidazole；5. 250 mmol/L 咪唑洗脫液 250 mmol/L imidazole lysis buffer； 6～7.陽離子交換柱的結果 Results of Q column；M. 蛋白分子量標尺 Protein molecular weight marker (Thermo #26630)

圖6Tricine-SDS-PAGE分析pst-1374效應蛋白在大腸桿菌中的表達及純化過程
Fig.6ExpressionandpurificationofHis-taggedpst-1374onTricine-SDS-PAGE

1～4. 蛋白表達的部分 The parts of expression；1.未誘導的大腸桿菌 The cell lysate before induction；2.IPTG誘導后 The cell lysate after induction；3.超聲波碎后的上清 The supernatant；4.離心后的沉淀 The pellet of cell lysate；5～8.鎳柱純化過程 The parts of nickel column purification；5.穿出液 Flowing through of supernatant of cell lysate during loading；6. 10 mmol/L的咪唑洗脫液 The wash of 10 mmol/L imidazole after loading；7、8. 250 mmol/L 咪唑洗脫液 Purification product eluted with 250 mmol/L imidazole lysis buffer；M1.蛋白分子量標尺(Thermo #26611) Protein molecular weight marker (Thermo #26611);M2.蛋白分子量標尺(Thermo #26617) Protein molecular weight marker (Thermo #26617)；9-10. HPLC純化后的電泳純蛋白 Present results of HPLC purification

圖7Tricine-SDS-PAGE分析pst-8713
Fig.7ExpressionandpurificationofHis-taggedpst-8713onTricine-SDS-PAGE

3 結論與討論

小麥條銹菌效應蛋白，是一類吸器分泌性蛋白，與條銹菌侵染和致病性密切相關。本試驗對于效應蛋白的研究，為以后揭開條銹菌侵染途徑提供基礎。

本研究證實效應蛋白在原核表達系統中可溶性表達。用常規的純化方法來純化，可得電泳純的蛋白質。純化后3個效應蛋白的水溶性很好，濃縮后都未發生蛋白質沉淀，為下一步通過核磁方法研究效應蛋白結構奠定基礎。

在 pst-1178的純化過程中，發現Tricine-SDS-PAGE電泳條帶分子質量大小與理論值不符合，通過不同鹽濃度下 pst-1178的15N-HSQC二維譜證明這個蛋白可能是聚合物[11]，進一步可采用動態光散射等方法來測定其分子質量并加以確證[10]。

今后，將通過解析效應蛋白的三維結構以及它們的體外、體內的蛋白互作試驗，深入探索效應蛋白的調控通路，為尋找跨膜方式和闡明條銹菌侵染機制，及更有效長久地防治小麥條銹菌提供借鑒。

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