一株酸奶發酵嗜熱鏈球菌的篩選及特性研究

官雪芳，鄭 怡，徐慶賢，錢 蕾，林 斌

(福建省農業科學院 農業工程技術研究所，福州 350001)

嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)是乳品發酵工業中重要的菌種[1]，全球每年消費的嗜熱鏈球菌乳制品市場價值約為400億美元[2],是公認的食品級安全性菌株(Generally recognized as safe, GRAS)。該菌已被衛生部列為可用于食品的菌種名單(衛辦監督發[2010]65號)，同時也被列入國食藥監注[2005]第202號發布的可用于保健食品的益生菌名單中，是兼具食品和保健性質的多功能益生菌。

嗜熱鏈球菌在發酵前期可以產生風味物質雙乙酰，在牛乳發酵及后熟過程中代謝產生胞外多糖[3]、細菌素和維生素[4]；其代謝產生的乳酸、甲酸、CO2等物質可刺激嗜酸乳桿菌的生長[5]，同時與保加利亞桿菌之間存在互生關系，在牛乳乳制品的生產中，該菌常作為引子與保加利亞乳桿菌(Lactobacillusbulgaricus)、瑞士乳桿菌(Lactobacillushelveticus)混合發酵生產酸奶以提高發酵乳品質、風味[6]及營養價值。

在熱及低溫殺菌的乳制品中能發現嗜熱鏈球菌的存在,有些馴化菌能夠在人體內耐受胃酸和膽鹽，并且可抑制腸道致病菌[4，7-8]，有利于腸道有益菌群的建立；同時可通過菌體同化作用、吸收和吸附、有機酸產物代謝等方式對膽固醇起到很好的降解作用[9-11]；此外，該菌還可在牛乳中生長時將無色的2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,TTC)還原為紅色三苯甲瓚而作為指示菌, 有利于牛乳中抗生素的殘留檢測[4]。

酸奶的風味及營養價值與使用的乳酸菌種類密切相關，獲得優質的乳酸菌菌種是發酵調配優質酸奶最核心的技術，因此篩選優質的酸奶發酵乳酸菌菌種一直是研究的熱點。基于嗜熱鏈球菌的以上特性，本研究致力于篩選能單獨發酵或與實驗室自有的酸奶發酵菌植物乳HLX37混合發酵生產酸奶的嗜熱鏈球菌，為提高酸奶的品質、風味及益生價值提供新的發酵菌源。

1 材料與方法

1.1 材 料

福建省農業科學院農業工程技術研究所微生物能源與環保實驗室自然發酵產生的具有酸奶風味的酸奶發酵液，鮮牛奶(福建長富乳業集團)。

1.2 主要試劑和儀器

細菌基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)。引物F(9-27)、R1525-1542(上海生工生物工程有限公司)，2×TaqPCR Master Mix(天根生化科技(北京)有限公司)，Eppendorf AG PCR儀器(艾本德中國有限公司)，Cary-50型紫外可見分光光度計(美國瓦里安技術中國有限公司)，YS100型顯微鏡(尼康儀器(上海)有限公司)，JSM-6380LV掃描電鏡(日本電子公司)，Alphalmager EP凝膠成像系統(Alpha innotech Corporation),Neofuge 15R臺式高速冷凍離心機(力康發展香港有限公司)，生化培養箱(上海新苗醫療器械制造有限公司)，QYC-200型恒溫搖床(上海新苗醫療器械制造有限公司)，SW-CJ-1F超凈工作臺(蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司)，酸奶發酵機(北京日創電器有限公司)，HT7700透視電鏡(日立高新技術公司)。

1.3 培養基制備

MC培養基(1 L)：大豆蛋白胨5.0 g，牛肉粉3.0 g，酵母粉3.0 g，葡萄糖20.0 g，乳糖20.0 g，碳酸鈣10.0 g，瓊脂20.0 g，中性紅0.05 g。制法：將前面7種成分加入蒸餾水中，加熱溶解，調節pH至6.0，加入中性紅混合均勻，定容至1 L,分裝后121 ℃高壓滅菌20 min。固體培養基在這基礎上加瓊脂粉20.0 g。

鮮牛奶：115 ℃高壓滅菌 20 min。

LB培養基(1 L)：胰蛋白胨 10.0 g，氯化鈉 10.0 g，酵母浸出汁 5.0 g，瓊脂 20.0 g， pH調至7.5。

1.4 乳酸菌的篩選

參照中華人民共和國國家標準(GB 4789.35-2010)中嗜熱鏈球菌計數法，采用MC培養基為篩選培養基，以自然發酵酸奶為樣品，從中吸取1 mL 自然發酵乳，分別稀釋10-5、10-6、10-7次方，各取0.1 mL涂布于含有MC固體培養基的平板上，待稀釋液被平板吸收后，采用限制高溫生長方法[12]，50 ℃倒置培養24 h，挑選出疑似嗜熱鏈球菌的暗紅色單菌落，分別在MC固體平板上劃線純化培養3次，同時各挑一單菌落于MC液體培養基中42 ℃靜置培養24 h,各取1 mL發酵菌液，分別接種入100 mL的鮮奶中，42 ℃發酵24 h，以鮮奶發酵凝固成固體并產生清香味為指標，挑選出達到這一指標的菌種，保存。繼續將菌株分別接入鮮奶中反復接種，于42 ℃發酵培養5次，觀察鮮奶發酵凝固成固體所需的時間，同時感官評價發酵酸奶的風味口感，挑選出1株能在42 ℃發酵10 h時使鮮奶發酵凝固成固體酸奶、風味口感最佳的疑似嗜熱鏈球菌菌株，保存并命名為LCM46。

1.5 菌株LCM46的鑒定

1.5.1 菌株的形態觀察 對菌體進行菌落形態觀察、電子顯微鏡觀察菌體革蘭氏染色形態、JSM-6380LV掃描電鏡及HT7700透視電鏡觀察菌體形態。

1.5.2 生理生化特征的鑒定 參照《伯杰細菌系統鑒定手冊》(第8版)[12]。

1.5.3 16S rDNA序列分析 細菌基因組DNA的提取:采用TIANGEN公司的細菌基因組DNA提取試劑盒提取。16S rDNA序列的PCR擴增及測序：擴增16S rDNA基因，所用引物為F(9-27):5′-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；R1525-1542:5′-AGAAAGGAGGTGATCCAGC- C-3′。 PCR反應體系:2×Mix 12.5μL,引物及DNA各1.0 μL,ddH2O 9.5 μL。PCR擴增程序： 93 ℃預變性4 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，共30個循環；最后72 ℃充分延伸10 min，4 ℃保存。擴增產物克隆后進行序列測定，測序委托鉑尚生物技術(上海)有限公司完成。

1.5.4 PCR產物檢測及測序分析 取5 μL的PCR產物，在加入EB的0.01 g/mL瓊脂糖凝膠中電泳分離,將含有目標片段的產物測序。將測得的序列提交到GenBank數據庫中，同時在該數據庫進行同源性分析。

1.5.5 系統發育分析 將測得的16S rRNA序列用NCBI的Blast程序進行序列同源性比對，用MEGA 4．1軟件中的Maximum Parsimony方法構建基于16S rRNA序列的系統發育樹。

1.6 菌株LCM46微生物學特性研究

嗜熱鏈球菌母液制備：取φ=20%甘油保存的LCM46 100 μL接種于100 mL的MC液體培養基中，37 ℃發酵培養24 h,制成菌種母液，備用。

1.6.1 最適酸奶發酵時間的測定 取嗜熱鏈球菌母液(下同)1 mL接種于含100 mL鮮牛奶(含0.08 g/mL蔗糖，105 ℃高壓滅菌40 min)的發酵瓶中，置于酸奶機中42 ℃分別靜置發酵10、11、12、13、15、17、34 h,制成酸奶制品，測定酸奶酸度(滴定法:GB5409-85)及嗜熱鏈球菌落數。

1.6.2 生長曲線測定 取嗜熱鏈球菌母液各100 μL分別接種于75管裝有10 mL MC液體培養基的試管中，37 ℃靜置發酵培養，以未接菌的培養基為對照，分別在發酵后1～96 h的不同時間段內取3管測定菌體OD600值。

1.6.3 最適發酵溫度的測定 取嗜熱鏈球菌母液各100 μL分別接種于裝有10 mL MC液體培養基的試管中，于10、20、30、40、50和60 ℃靜置發酵培養24 h,測定發酵液OD600，依據以上結果，以同樣的方法，設計溫度32.5、35、37.5、40.0和42.5 ℃，獲得精確的最適發酵溫度。

1.6.4 最適發酵pH的測定 取嗜熱鏈球菌母液各100 μL分別接種于裝有10 mL不同pH的MRS液體培養基的試管中，37 ℃靜置發酵培養24 h,測定發酵液OD600值。

1.6.5 耐酸測定 取LCM46母液1 mL接種菌種于不同pH(pH梯度為2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0) 的10 mL MC液體培養基，42 ℃分別培養0、2、4 h，每一處理3個重復。各取1 mL樣品菌液于9 mL生理鹽水中混勻，制備10-3個稀釋度溶液，取0.1 mL稀釋液于MC中涂布， 42 ℃ 倒置培養48 h(每個處理3個平行)，計算平板上的菌數。

1.6.6 菌株的黏附能力測定 培養嗜熱鏈球菌(MC液體培養基)、大腸桿菌DH5α(LB液體培養基)24 h得發酵液，分別于3 000 r/min、4 ℃下離心10 min，收集菌泥，依次用pH 7.0的無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌菌泥2次(即在菌落中加入PBS，震蕩混合均勻后，置于3 000 r/min、4 ℃下離心10 min，收集菌體)。自凝集率：用無菌的PBS將菌泥HLX37制成在波長600 nm處的吸光值為0.4±0.1(A0)的懸浮菌液，靜置24 h后測定吸光值A24，自凝集率=(A0-A24)/A0×100%。他凝集率：將HLX37和大腸桿菌DH5α的懸菌液調節成在波長600 nm處的吸光值為0.6±0.1(A0)的混合懸浮菌液。靜置24 h后測定吸光值A24，他凝集率=(A0-A24)/A0×100%。

2 結果與分析

2.1 疑似嗜熱鏈球菌的獲得

在50 ℃ MC固體培養基平板上，挑選出疑似嗜熱鏈球菌的暗紅色單菌落15個，其中能在42 ℃發酵24 h使鮮奶發酵凝固成固體并產生清香味的菌株有5株，反復接種5次后，最終挑選出1株能在42 ℃發酵10 h時使鮮奶發酵凝固成固體酸奶、通過感官品評獲得的風味口感最佳，產生酸奶質地粘稠的乳酸菌菌株，保存并命名為LCM46。

2.2 菌種的鑒定

2.2.1 菌株LCM46的形態觀察 LCM46菌株的主要形態特征如下：菌落圓，光滑，在MC培養基上呈暗紅色、不透明，革蘭氏陽性，菌體橢圓，寬0.7～0.9 μm,長0.8～1.9 μm，成對到長鏈(圖1)。

2.2.2 生理生化特征的鑒定 LCM 46菌株生理生化特征見表1，具體為：VP試驗、淀粉水解試驗和奈試產氨試驗呈陽性， MR、過氧化氫試驗、明膠試驗和吲哚試驗顯示陰性，說明該菌能分解利用大分子含氮物質，能產生淀粉酶將淀粉水解為糖類物質，能將葡萄糖分解產生丙酮酸，不能利用明膠。能發酵利用α-乳糖、葡萄糖、蔗糖產酸、不產氣；不能利用麥芽糖、D-果糖。

A.菌落形態圖 Colony characteristics inoculated in MC medium;B.革蘭氏染色圖 Gram staining;C.掃描電鏡圖譜 Scanning electron microscopy(SEM);D.透視電鏡圖譜 Transmission electron microscope(TEM)

圖1菌株LCM46的形態
Fig.1ColonycharacteristicsandmorphologyofLCM46strain

表1 LCM46菌株的生理生化特征Table 1 Morphological and physiological characteristics of LCM46 strain

注： + 陽性;- 陰性。

Note：+. Positive; -. Negative.

2.2.3 LCM46菌的分子生物學鑒定 對菌株LCM46的16S rDNA序列PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳(圖2)，并測序獲得該序列長度為1 416 bp，在NCBI數據中對該序列進行Blast比對分析，得到序列Streptococcusthermophilus的序列同源性為100%，采用 MEGA 5.2中的Neighbor-joining進行發育樹的構建分析(圖3)，菌株LCM46與Streptococcusthermophilus對應遺傳距離最近，結合形態觀察和生理生化試驗，確定菌株LCM46即為嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)，序列在GenBank中申請得到的登錄號為KR105939。

2.3 LCM46特性研究

2.3.1 LCM46菌最適酸奶發酵時間 由圖4可知：經菌LCM46發酵后，發酵乳的酸度最高上升至(90.65±0.17)°T，發酵到11 h時，酸度為(80.77±0.17)°T，此時的發酵乳酸甜適宜，質地穩定，口感脆嫩，無乳清析出，散發出清淡的酸奶清香味，酸奶質量最佳。此時的菌落數為(11.71± 0.20)×108cfu/mL，當發酵到17 h時，菌落數達到最大值(34.00± 0.02)×108cfu/mL，酸度亦達到(89.36±0.17)°T，之后隨著發酵時間的延長，菌落數迅速下降。

圖2 菌的PCR擴增片段圖譜Fig.2 The agarose electrophoresis of 16S rDNA PCR product

圖3 菌株LCM46的系統發育樹圖譜Fig.3 Phyogenetic tree of LCM46 strain based on 16S rDNA sequences homology

圖4 發酵時間對酸奶酸度及菌落數影響Fig.4 Effect of fermentation time on acidity and number of LCM46 in fermented milk

2.3.2 LCM46生長曲線 由圖5可知：菌LCM46發酵到2 h時進入對數生長期，發酵到12 h 時進入穩定期，此時菌體OD600值為0.55±0.00。

圖5 菌株LCM46生長曲線Fig.5 The growth curve of LCM46 strain

2.3.3 LCM46最適發酵溫度 由圖6可知：菌株LCM46最適發酵溫度為40 ℃，菌體OD600值為0.85±0.09，發酵到60 ℃時菌的OD600值降到0.17±0.01，說明該菌能在50 ℃的高溫時生長，耐受溫度亦達到60 ℃。

2.3.4 LCM46最適發酵pH 由圖7可知：LCM46菌最適發酵初始pH為6.0，菌體OD600值為0.89±0.01，當初始pH小于4.3或大于7.5時，菌的OD600值均低于0.1，處于停滯生長狀態，說明該菌適合生長的初始pH為4.3～7.5。MC培養基經LCM46發酵后，發酵菌液pH下降至3.8～5.0。說明菌LCM46具有一定的產酸能力。

圖6 溫度對菌LCM46生長的影響Fig.6 Effect of temperature on the growth of LCM46 strain

圖7 初始pH對菌株LCM46生長的影響Fig.7 Effect of initial pH on the growth of LCM46 strain

圖8 LCM46耐酸能力Fig.8 Acid resistant ability of LCM46 strain

2.3.5 LCM46耐酸能力 從圖8可知：隨著處理時間的增加及所處pH環境的下降，菌落數呈下降趨勢，當pH≤4.5時，存活率均低于100%，當低于3.0時，菌不能生長；在臨界pH=3.5,培養4 h后，菌落為(0.87±0.03)×105cfu/mL，存活率達63.04%±3.01%。 說明該菌有一定的耐酸能力，但酸的作用對菌的生長影響顯著。

2.3.6 菌株HLX37的黏附能力 從表2可知：菌LCM46的自凝集率為19.28%，對大腸桿菌DH5α的凝集率為12.32%，黏附能力較差。

表2 菌株LCM46黏附能力Table 2 Adhesive ability of LCM46 strain

3 討 論

在50 ℃的篩選條件下，采用MC培養基為篩選培養基，從自然發酵酸奶中獲得1株能發酵產生優質酸奶的疑似嗜熱鏈球菌，命名為LCM46，經形態學觀察、生理生化特征鑒定、16S rDNA基因序列測定及系統發育樹同源性分析，鑒定為嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)，該菌最適發酵溫度為40 ℃，耐受溫度可達到60 ℃。說明采用MC為嗜熱鏈球菌條件篩選培養基并配合高溫條件篩選法比較容易獲得嗜熱鏈球菌菌種。

嗜熱鏈球菌屬于鏈球菌屬(Streptococcus)，本研究獲得的嗜熱鏈球菌LCM46對數生長期為2～12 h,最大OD600只有0.55，但在以牛乳為基質的發酵乳中，LCM46發酵到口感最佳狀態菌落數可達到(11.71±0.20)×108cfu/mL，當發酵到17 h時，菌落數達到最大值，說明牛乳是該菌最適合生長的基質，而MC只適合作為嗜熱鏈球菌的條件篩選培養基；測定菌LCM46最適發酵pH為6.0，適合生長初始pH為4.3～7.5，低于4.3時處于停滯生長狀態，處在這一酸性環境下的時間越長,菌的致死率越大，在低于3.0時，處理2 h即可全部致死。因此，在牛乳發酵中由于大量的乳糖被發酵產生乳酸等酸性物質，使得發酵乳的酸度大大提高，在發酵到34 h時，發酵乳酸度已達到(89.36± 0.17)°T(測得的pH為3.5左右)，菌落數只有(0.18±0.06)×108cfu/mL，存活率僅為0.53%，但依然超過活菌發揮功能特性的菌數臨界值(106cfu/mL)[13]，在應用該菌生產發酵乳時，為避免影響活菌的數量，發酵的時間不宜過長，發酵乳的酸度不宜過低。

檢測菌LCM46的自凝集率和對大腸桿菌DH5α的凝集率分別為19.28%和12.32%，雖然黏附能力不強，產生的細胞蛋白有限，益生菌效果受到一定影響[14],但這一特性使得產生的發酵乳質地脆嫩，和高黏附力的菌種混合發酵生產的發酵乳有希望大大改善高黏附產生的質地粘稠的性狀。

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