HPLC法測定新型降糖藥安奈格列汀片含量

姜業朝， 龔愛琴， 張宇航

(揚州工業職業技術學院,江蘇 揚州 225127)

*聯系人：龔愛琴，女，1974年出生，博士研究生，副教授。研究方向：儀器分析、藥物分析。

提出了一種高效液相色譜法測定安奈格列汀含量的新方法。采用VP-ODS(250 mm×4.6 mm,5 μm)色譜柱，以10.0 mmol/L磷酸二氫鉀-乙腈緩沖液(pH=5.5)(60∶40)為流動相，流速為0.80 mL/min，檢測波長為248 nm。結果發現，安奈格列汀的質量濃度為2.0 μg/mL～50.0 μg/mL時，進樣量與峰面積呈良好的線性關系，線性方程為A=103.91c+23.45，r=0.999 8，平均回收率為99.71%，RSD為0.50%(n=9)。實驗結果表明，該方法結果準確、專屬性強，適用于安奈格列汀的質量控制及含量檢測。

安奈格列?。唤堤撬?；HPLC；測定

新型降糖藥安奈格列汀(anagliptin)結構式如圖1所示，2012年在日本首次上市，屬于二肽基肽酶-4抑制劑(DPP-4)，對DPP-4酶具有強效、高選擇性抑制作用，目前中國尚在臨床階段。在日本進行的一項臨床研究表明，安奈格列汀具有顯著改善血糖水平的效果，與阿卡波糖等聯合使用能更有效地改善血糖控制，并且不會使患者體重增加或發生低血糖現象[1，2]，因此，該藥具有良好的應用前景。但文獻調研顯示，該藥含量的測定方法國內外報道很少。目前，藥物含量測定方法應用較多的是HPLC[3-6]。本研究擬采用HPLC法測定安奈格列汀含量，旨在為藥物的質量控制提供方便有效的檢測方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

大連伊利特高效液相色譜儀，帶紫外檢測器和N2000數據處理工作站；上海美普達1801紫外-可見分光光度計；上海精科雷磁pH S-25酸度計。

圖1 安奈格列汀結構式

安奈格列汀標準品和藥片(批號20160801、20160802、20160803，規格100 mg/片)；乙腈(色譜純)、磷酸二氫鉀(分析純)，購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 溶液配制

1.2.1 流動相

10 mmol/L磷酸二氫鉀(取磷酸二氫鉀0.68 g，加水溶解并稀釋至500 mL，用氫氧化鉀調節pH值至5.5)-乙腈緩沖液，體積比為60∶40，用0.45 μm微孔濾膜過濾脫氣后使用。

1.2.2 對照品溶液的制備

精密稱取安奈格列汀對照品適量，加水溶解并定量稀釋，制成每1 mL中含安奈格列汀0.1 mg的溶液，作為對照品溶液。

1.2.3 供試品溶液的制備

取安奈格列汀藥片5片，研磨均勻。取樣品粉末適量，加水溶解并定量稀釋，制成每1 mL中約含安奈格列汀0.1 mg的溶液，過濾。取續濾液作為供試品溶液。

1.2.4 陰性對照溶液的制備

根據安奈格列汀片制劑配方，配制不含安奈格列汀的陰性對照粉末。精密稱取陰性對照粉末適量，按照“供試品溶液的制備”方法制備陰性對照溶液。

1.3 色譜條件

色譜柱：Shimadzu VP-ODS(250 mm×4.6 mm,5 μm)；柱溫：20 ℃；檢測波長248 nm；進樣量20 μL。

1.4 實驗方法

取各項目下溶液，進樣20 μL，注入液相色譜儀，在色譜條件下測定，記錄色譜圖，按外標法以峰面積計算其含量。

2 結果與討論

2.1 測定波長的選擇

實驗中掃描了安奈格列汀的吸收光譜曲線，結果如圖2所示。由圖2可知，安奈格列汀在248 nm處有最大吸收。因此，選擇248 nm作為HPLC中的檢測波長。

圖2 安奈格列汀吸收曲線

2.2 流動相的選擇

實驗中分別嘗試了甲醇、乙腈、甲醇-水、乙腈-水，但發現出峰效果均不理想。改為磷酸二氫鉀-乙腈溶液為流動相后，出峰效果慢慢改善，并且峰形隨兩者配比的變化而不同。當磷酸二氫鉀-乙腈溶液體積比為60∶40時，峰形對稱且峰較窄(見圖3)。實驗中選用磷酸二氫鉀(10 mmol/L磷酸二氫鉀溶液，用氫氧化鉀調節pH至5.5)-乙腈溶液=60∶40為流動相。

2.3 工作曲線與檢出限

取對照品適量，分別配成2.0、5.0、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0 μg/mL的標準溶液，在1.3色譜條件下，分別精密量取20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以峰面積(A)與濃度(c)進行線性回歸。結果表明，安奈格列汀質量濃度在2.0 μg/mL～50.0 μg/mL線性關系良好，回歸方程為A=103.91c+23.45，r=0.999 8。

圖3 磷酸二氫鉀-乙腈(60∶40)為流動相時色譜圖

取5.0 μg/mL的標準溶液逐級稀釋，測定方法的檢出限與定量限。結果發現，檢出限(S/N≥3)為0.1 μg/mL，定量限(S/N≥10)為0.3 μg/mL。

2.4 方法的精密度、再現性與穩定性

取線性關系中的20.0 μg/mL溶液連續進樣6針，以峰面積評價方法的精密度。結果表明，6個峰面積的RSD為0.33%，表明方法具有較好的重現性。

由3個不同人員分別取同一份供試品，按照色譜操作條件測定安奈格列汀含量，每人平行測定2次，用外標法計算含量，測得數據分別為100.2%、99.81%、99.21%、99.48%、99.70%、100.5%，RSD為0.21%，表明方法的再現性較好。

取批號為20160801供試品溶液，在10 h內每隔2 h分別測定一次峰面積。結果顯示，峰面積的RSD為0.26%，表明樣品溶液在10 h內穩定性良好。2.5 回收率實驗

取陰性對照品溶液，加入適量對照品，分別制成質量濃度為10.0、20.0、30.0 μg/mL的樣品溶液，每種溶液平行配制3份，測定其峰面積，用外標法計算回收率。結果顯示，回收率分別為99.20%、99.51%、99.43%、99.77%、100.5%、99.40%、99.69%、99.51%、100.61%。平均回收率為99.71%，RSD為0.50%，表明方法的回收率較好，共存組分干擾小。2.6 樣品測定

用本方法對3批樣品進行了測定，結果含量分別為標示量的99.5%(20160801)、100.5%(20160802)、99.3%(20160803)。

3 結論

提出了一種高效液相色譜法測定新型降糖藥安奈格列汀含量的新方法，對流動相的種類進行了優化。精密度、穩定性、回收率實驗均表明，方法的準確度高、重現性好，可以用于實際樣品分析，從而拓展了安奈格列汀含量測定方法。

[1] Shinya Nishio,Mariko Abe,Hiroyuki ito.Anagliptin in the treatment of type 2 diabetes:safety,efficacy,and patient acceptability[J].Diabetes,Metabolic Syndrome and Obesity:Targets and Therapy,2015(8):163-171.

[2] Hidetaka Hamasaki,HidekatsuYanai.The development of angioedema in a patient with type 2 diabetes due to a noveldipeptidyl peptidase-IV inhibitor,anagliptin[J].Int J Cardiol,2013,168:e106.

[3] 倪贊,謝循策,劉萌.HPLC法測定保健食品中非法添加的12種鎮靜安神類化學藥物[J].中國衛生檢驗雜志,2014,24(17):2491-2493.

[4] 陳吉之,閆超.飼料中9種磺胺類藥物的HPLC法快速分離與檢測[J].中國醫藥工業雜志,2015,46(8):892-894.

[5] 馬蘭.色譜法在藥物分析中的應用[J].天津藥學,2014,26(1):65-67.

[6] 李娜,朱平,王志敏.HPLC法測定注射用頭孢西丁鈉中有關物質[J].山西化工,2008,28(3):29-32.