響應面法優(yōu)化小球藻多糖提取工藝研究

史瑞琴，李大偉，梁靜靜，王頡，馬艷莉

（河北農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，河北保定071000）

小球藻（chlorella）屬于綠藻門小球藻屬的單細胞綠藻，具有光合能力強、分布范圍寬、繁殖快以及應用價值高等特點[1-2]。我國目前常見的普通小球藻細胞內含有可觀碳水化合物、蛋白質以及多種維生素，是一種天然的營養(yǎng)均衡的食物來源，而小球藻多糖具有很強的生物活性，如：調免疫、降血脂、降血糖等，可用于臨床醫(yī)學、保健食品研發(fā)以及化妝品研制等[3]。

植物多糖常與脂質、蛋白質等結合形成結構復雜的多糖混合物，使多糖的高效提取造成一定困難[4-5]，而且單一使用酸、堿提法，超聲波法，微波法等都會損失一定量的多糖，所以研究兩種或多種提取方法的有效結合對植物多糖的提取具有重大意義。早期，多糖的提取采用提取效率極低的水提醇沉法[6]，而近年來隨著酶技術、超聲波技術以及微波技術[7-8]的不斷深入研究，使得這些方法在實踐中成功應用。酶技術與超聲波技術的有效結合可加速原料中多糖溶入溶劑，從而進一步使多糖的提取率增加[9]。因此，使用超聲波結合復合酶提取小球藻多糖、提高小球藻多糖的提取率對開發(fā)小球藻資源具有重大意義。本試驗采用單因素和響應面法優(yōu)化小球藻多糖提取工藝，為研發(fā)小球藻多糖保健品確立了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

小球藻粉：西安百川生物科技有限公司；木瓜蛋白酶（酶活力≧60萬單位/克）和纖維素酶（酶活力≧3千單位/克）：北京索萊寶科技有限公司；氫氧化鈉（NaOH）、苯酚（C6H5OH）：上海市沃凱生物技術有限公司；95%乙醇（C2H5OH）：石家莊新宇三陽有限公司；濃硫酸（H2SO4）：河南開化化工產(chǎn)品經(jīng)銷有限公司；葡萄糖（C6H12O6）：山東天力化學試劑有限公司。

AR423CN電子天平、STARTER 2100實驗室pH計：奧豪斯（上海）儀器有限公司；H.SWX-600BS電熱恒溫水浴箱：常州朗博儀器制造有限公司；SK5200H超聲波清洗器：廣州科導儀器設備有限公司；Neofuge15R高速冷凍離心機：上海力申科學儀器公司；DHG-9143B5-Ⅲ電熱恒溫鼓風干燥機：上海新苗醫(yī)療制造有限公司；752型紫外分光光度計：上海青華科技儀器有限公司；DL-1萬用電爐：北京中興偉業(yè)儀器有限公司。

1.2 工藝流程

稱取小球藻粉1 g→加適量蒸餾水→超聲30 min→調pH→加酶→酶解30 min→滅酶→熱水浸提（70℃，4 h）→離心（4 500 r/min，0℃，15 min）→過濾取上清液→添加3倍體積95%乙醇→4℃靜置過夜→離心（4 500 r/min，0℃，15 min）→烘干→粗多糖

1.3 小球藻多糖含量測定

1.3.1 葡萄糖標準曲線的繪制

分別吸取 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL 的標準葡萄糖溶液（0.1 mg/mL）置于25 mL試管中，加蒸餾水補至2.0 mL。編號0-6號，分別添加1.0 mL 6%苯酚溶液與5.0 mL濃硫酸，在自然條件下反應5 min并經(jīng)過沸水浴10 min后冷卻到室溫。將0號作為對照，在490 nm處測定其的吸光度。分別以葡萄糖濃度、吸光度值為橫、縱坐標，制作葡萄糖含量的標準曲線。得到的標準曲線回歸方程為：Y=13.142 86X-0.002，R2=0.999 6。

1.3.2 樣品測定與分析

對干燥后的小球藻多糖進行溶解并稀釋至合適濃度之后，用苯酚硫酸法[10]測定小球藻多糖含量，多糖提取率為[11]：

多糖含量/%=（測量濃度×稀釋倍數(shù)×反應液體積/粗多糖的質量）×100

多糖提取率/%=（粗多糖的質量/原料質量）×100

1.4 單因素試驗

為了探究復合酶對小球藻多糖提取率的影響，首先應確定復合酶的作用效果是否比單一酶的效果好，為此設定反應條件：液料比 25∶1（mL/g），pH 值 5，酶解溫度50℃。然后分別選擇不同添加量的纖維素酶、木瓜蛋白酶以及2種酶的復合酶，對小球藻藻液持續(xù)酶解30 min，對溶液處理后，測定小球藻多糖的提取率。

選用優(yōu)化后的酶種類及添加量，控制其他反應條件，如：pH 值5、50℃酶解，測定不同液料比 10∶1、15∶1、20 ∶1、25 ∶1、30 ∶1（mL/g）時小球藻多糖的提取率；依據(jù)其結果選擇最優(yōu)組合，控制酶解溫度50℃，分別測定 pH3、4、5、6、7 時小球藻多糖的提取率；擇其最優(yōu)組合，測定酶解溫度為 30、40、50、60、70 ℃時小球藻多糖的提取率。每個試驗重復3次。

1.5 響應面優(yōu)化試驗

在單因素試驗的基礎上，以液料比（A），復合酶添加量（B），pH 值（C），酶解溫度（D），小球藻多糖提取率為自變量和唯一響應值，按照Box-Behnken的中心組合設計規(guī)律，采用四因素三水平的響應面法操作試驗，并優(yōu)化小球藻多糖的提取條件。分析因素及水平見表1。

表1 因素水平取值和編碼表Table 1 Factor level values and coding tables

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

本試驗主要通過Origin Pro 7.5對數(shù)據(jù)進行處理與分析，并用Design-Expert 8.05軟件處理分析試驗結果，依據(jù)F值考察二次回歸模型及因素的顯著性（P＜0.05）。

2 結果分析

2.1 復合酶法提取小球藻多糖的單因素試驗

2.1.1 酶種類和添加量對小球藻多糖提取率的影響

酶種類和添加量對小球藻多糖提取率的影響見表2。

表2 酶種類和添加量對小球藻多糖提取率的影響Table 2 Effects of enzyme types and amount on extraction rate of polysaccharide from chlorella

續(xù)表2 酶種類和添加量對小球藻多糖提取率的影響Continue table 2 Effects of enzyme types and amount on extraction rate of polysaccharide from chlorella

由表2可見，使用酶的種類不同，小球藻多糖的提取率也不同，但小球藻多糖得率的變化趨勢基本相同，都是當酶的添加量增加時而隨之增大，到達一定程度后稍有降低。單獨使用一種酶或使用復合酶的添加量為1.5%時，小球藻多糖的提取率均達到最高。其中使用1.5%的復合酶時，小球藻多糖的提取率最大（5.25%）。因此，本試驗擬定使用復合酶進行試驗。

2.1.2 復合酶添加量對小球藻多糖提取率的影響

復合酶添加量對小球藻多糖提取率的影響見圖1。

圖1 復合酶添加量對小球藻多糖提取率的影響Fig.1 Effect of compound enzyme amount on extraction rate of polysaccharide from chlorella

由圖1可得，多糖提取率在酶添加量增大時呈現(xiàn)出上升趨向，而且在酶的添加量為0.5%到1.5%時增長較快，到達1.5%后緩慢降低。出現(xiàn)這種變化趨勢的原因可能是添加適量酶時可促進多糖的溶解，但是當添加過量酶時底物反應完全后，酶會進一步分解糖苷鍵，導致小球藻多糖提取率降低。因此選取1.5%為適宜的復合酶添加量。

2.1.3 液料比對小球藻多糖提取率的影響

液料比對小球藻多糖提取率的影響見圖2。

圖2 液料比對小球藻多糖提取率的影響Fig.2 Effect of the ratio of solvent to material on extraction rate of polysaccharide from chlorella

由圖 2可得，當液料比例為 20∶1（mL/g），小球藻多糖的得率達到最大，之后隨著液料比的增大小球藻多糖的得率趨于穩(wěn)定。表明當液料比為20∶1（mL/g）時多糖基本已溶出充分。因此選取20∶1（mL/g）的液料比。

2.1.4 pH值對小球藻多糖提取率的影響

酶解pH值對小球藻多糖提取率的影響見圖3。

圖3 酶解pH值對小球藻多糖提取率的影響Fig.3 Effect of pH value on extraction rate of polysaccharide from chlorella

由圖3可得，當pH值過小時會對小球藻多糖的得率造成較大的影響，當pH值為5.0時，小球藻多糖的得率最大，隨后pH值持續(xù)增大時，多糖的得率反而降低。這可能是由于兩種酶的最適pH值均偏酸性，當溶液pH值為中性時，酶的活性降低影響小球藻多糖的提取率。綜上所述，試驗比較適宜的pH值為5.0。

2.1.5 酶解溫度對小球藻多糖提取率的影響

酶解溫度對小球藻多糖提取率的影響見圖4。

由圖4可得，當進行40℃酶解時，小球藻多糖的提取率達到頂峰。當酶解溫度小于40℃時，小球藻多糖提取率隨酶解溫度的提高而隨之增大，這可能是因為酶解溫度增大時，反應物與底物分子之間的碰撞越強烈，反應物與酶之間互相接觸的幾率大大提高。但當酶解溫度達到40℃后，在高溫條件下，酶的化學結構遭到破壞，導致酶活性降低，從而使小球藻多糖的提取率降低。綜上所述，40℃為比較適宜的酶解溫度。

圖4 酶解溫度對小球藻多糖提取率的影響Fig.4 Effect of enzymatic temperature on extraction rate of polysaccharide from chlorella

2.2 小球藻多糖提取的響應面結果分析

2.2.1 響應面試驗設計及結果

在單因子試驗基礎上，選擇液料比（A）、復合酶添加量（B）、pH（C）、酶解溫度（D）4個變量，并采用響應面法優(yōu)化復合酶法提取小球藻多糖的條件，其結果如表3所示。

表3 Box-Behnken試驗設計及結果Table 3 Box-Behnken test design and results

續(xù)表3 Box-Behnken試驗設計及結果Continue table 3 Box-Behnken test design and results

通過對實驗數(shù)據(jù)分析，可得小球藻多糖提取率的二次多項回歸方程：

Y=6.56-0.075A-0.060B+0.41C-0.13D-0.11AB+0.49AC-0.12AD-0.14BC-0.010BD-0.073CD-0.32A2-0.47B2-1.08C2-0.61D2

式中：Y為小球藻多糖提取率。對該模型的方差及顯著性進行分析，結果見表4。

表4 二次回歸方程方差分析Table 4 Analysis of variance the regression model

由表4可以得出，二次多項的回歸項P值為0.002 6，差異顯著（P＜0.05），失擬項 P 值為 0.234 1，不顯著（P＞0.05）。所以該模型的擬合度較高，可以用于對二次回歸方程的相應值進一步預測；此外，該模型的決定系數(shù)R2=0.830 7，表明預測值與真實值有較高的相關性；而變異系數(shù)CV=0.134 5，說明試驗可操作性較好。綜上述分析可知，此模型可以用來分析和預測小球藻多糖提取率的真實情況。每種因子對小球藻多糖得率的影響程度為：pH＞酶解溫度＞液料比＞復合酶添加量。

2.2.2 響應面分析

按照回歸模型繪制響應曲面三維圖，從而清晰地呈現(xiàn)出料液比、復合酶添加量、pH、酶解溫度對小球藻多糖得率的影響，其結果如圖5～圖10所示。

圖5 復合酶添加量與液料比對提取率的響應面圖Fig.5 Effects of compound enzyme amount and ratio of solvent to material on extraction ratio

圖7 酶解溫度與液料比對提取率的響應面圖Fig.7 Effects of enzymolysis temperature and ratio of solvent to material on extraction ratio

圖8 pH與復合酶添加量對提取率的響應面圖Fig.8 Effects of pH and compound enzyme amount on extraction ratio

圖9 酶解溫度與復合酶添加量對提取率的響應面圖Fig.9 Effects of enzymolysis temperature and compound enzyme amount on extraction ratio

圖10 酶解溫度與pH對提取率的響應面圖Fig.10 Effects of enzymolysis temperature and pH on extraction ratio

響應曲面圖可以表示試驗因素的每個水平之間與響應值的函數(shù)關系，同時可直觀的獲取試驗設計中的最優(yōu)工藝參數(shù)。由圖5～圖10可知，料液比與pH的交互作用顯著，pH與復合酶添加量、液料比與酶解溫度、料液比與復合酶添加量、pH與酶解溫度之間的交互作用依次降低，復合酶添加量與酶解溫度之間的交互作用最小。通過對響應面圖的陡峭程度分析可知，pH對小球藻多糖得率的影響最大，酶解溫度與液料比對其影響相對較小，而復合酶添加量的影響最低，這與前面方差分析結果一致。

2.2.3 最佳提取工藝條件的預測與驗證

經(jīng)響應面法優(yōu)化，軟件Design-Expert.V8.0分析得復合酶法提取小球藻粗多糖的最佳的條件為液料比20.48∶1、復合酶添加量1.45%、pH值5.22、酶解溫度38.76℃，此條件下小球藻多糖提取率的預測值為6.617%。為使得現(xiàn)實中更加便捷地進行試驗，將上述預測的最佳條件修改為液料比20∶1（mL/g）、復合酶添加量1.45%、pH值5以及酶解溫度39℃。為檢驗模型是否可靠，對上述修改后的提取條件做3次重復驗證試驗，小球藻多糖提取率平均為6.56%，實際值和預測值的相差為0.52%。證明所建立的模型對預測小球藻多糖得率是準確可行的。

3 結論

本試驗通過對不同液料比的小球藻藻粉溶液進行超聲波處理后，使用復合酶法對小球藻多糖進行浸提，選取料液比、復合酶添加量、pH值和酶解溫度執(zhí)行單因素試驗，并確定各水平后使用響應面優(yōu)化提取條件，即小球藻多糖的最佳提取條件為：液料比20∶1（mL/g）、復合酶添加量1.45%、pH值5、酶解溫度為39℃。本試驗為小球藻多糖的提取方法及提取條件提供了一定的理論參考。

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