龍葵果色素和生物堿的研究進展

劉銳，李茂，謝博君，潘勤

（1.天津市中藥質量控制（企業）重點實驗室，天津中新藥業研究中心，天津300457；2.天津市醫藥集團有限公司，天津300204）

龍葵（Solanum nigrum L.）為茄科茄屬一年至多年生草本植物。全國均有分布，常見于農田、荒地、村莊等地。龍葵果未成熟時為綠色，成熟時為紫黑色。未成熟的龍葵果含大量甾體生物堿成分，具有很強的抗腫瘤活性。而成熟的龍葵果中生物堿消失殆盡，富含花青素類、維生素、氨基酸等成分，營養價值極高，可作為野生水果食用。其中的花青素類色素也可作為新的資源來提取開發天然食用色素。目前食品工業上所用的色素多為合成色素，但安全性問題使其應用受到限制。而天然色素由于安全性高，且大多具有營養保健功能，受到人們廣泛關注。近些年來不少植物色素如山楂紅色素、菊花黃素、紫草素、茶色素等被開發應用到大健康產業中[1]。龍葵果資源豐富，廉價易得，其中的花青素類色素以及甾體生物堿類成分具有很高的應用價值。本文就龍葵果色素提取方法、純化工藝、穩定性、安全性以及生物堿的提取純化工藝、抗腫瘤活性等方面的研究概況作綜述，并展望其應用前景，為其深入開發和合理應用提供參考。

1 龍葵果色素研究進展

1.1 提取方法研究

崔艷莉等[2]以成熟龍葵果實為原料，采用浸提法對紅色素的最佳浸提條件進行了研究，探討了浸提劑、物料配比、浸提時間、浸提溫度及浸提次數等因素對龍葵紅色素提取量的影響。結果表明，龍葵果紅色素的最大吸收峰波長為520 nm，以4.5%的鹽酸為浸提劑，物料配比（w/v）為1∶10，在60℃的條件下浸提4 h，紅色素的提取量最大，且連續浸提2次，總提取率可達90%以上。劉良等[3]用pH 2-4的95%食用乙醇從龍葵成熟果中提取出一種瑰玖紅色的龍葵色素，并對其提取方法進行了研究。對比了甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、水等溶劑對龍葵色素浸出效果，選擇95%食用乙醇為提取溶劑，pH 2為最佳使用條件，破碎的龍葵果與提取溶劑之比為1∶6。經等同時間下25、45、50、60℃浸取溫度的對比，選擇溫度低、時間短、浸取率高的常溫攪拌提取為最佳提取條件。提取時間為16 h～20 h，提取 4 次，每次 4 h～5 h，三、四次浸液做為下批原料的一、二次提取溶劑。所得產品為黑紫色無定粉末，提取率為3.5%～4%，色價24.2。劉志明等[4]以成熟的龍葵果為原料提取食用紅色素，通過優化工藝、確定單因素條件、設計正交試驗，以527 nm波長的吸光度值衡量色素提取效果和穩定性，結果表明最優化的提取條件為檸檬酸水溶液提取劑pH 1.72，樣品加量3.35 g/100 mL，提取溫度60℃，浸提時間60 min。范翠麗等[5]以龍葵果為原料，分別采用常溫提取、水浴鍋熱提取、微波輔助提取、超聲波輔助提取，對龍葵果紅色素的浸提條件及浸提方法進行了系統研究。通過對4種提取方法的吸光度和得率及試驗方法的可行性進行比較分析來篩選龍葵果紅色素的最佳提取方法及工藝條件，結果表明微波輔助提取法吸光度和得率最高。袁博等[6]以檸檬酸水溶液為溶劑，水浴浸提法提取龍葵果紅色素，考察提取溫度和時間對紅色素提取量的影響，將檢測結果用SPSS 17.0軟件進行分析，并建立影響因素數學模型。結果顯示浸提液的A527 nm隨提取溫度升高呈先增后減的趨勢，隨提取時間延續呈現出先急后緩的增加趨勢，提取溫度與紅色素的提取量間存在二次函數關系，提取時間與紅色素提取量間存在對數函數關系。數學模型顯示葵果紅色素在50℃～60℃的提取溫度、70 min的提取時間下提取效果較好。徐亞維等[7]通過正交試驗，確定野生龍葵果中原花青素的最佳提取工藝條件為：提取溶劑為pH 3的60%乙醇，料液比1∶15，提取溫度25℃，提取時間80 min。此優化條件下提取野生龍葵果中原花青素的含量最高，達0.055 2%。騰飛等[8]以60%乙醇為提取溶劑，在pH值、提取溫度、提取時間和液料比4個單因素試驗的基礎上，利用中心組合試驗對提取條件進一步優化，得到龍葵果花色苷最佳提取條件為pH 1.0，提取溫度29℃，提取時間85.5 min，料液比1∶25。在此條件下提取，花色苷得率為（0.86±0.03）mg/g。

文獻報道龍葵果色素多以酸性水溶液或醇溶液浸提。對于色素的提取而言，升高溫度有利于色素的溶出，但持續加熱會使色素發生降解，減少提取率，因此在提取時應充分考慮溫度和時間對色素提取率的影響，選擇最佳提取溫度和時間。在濃縮、干燥等后處理過程中也應當注意熱降解產生的影響。

1.2 純化工藝研究

龍葵果粗提物中雜質多，會影響色素的著色度和色價，同時未精制的色素由于多糖等雜質的影響不容易制成粉末，容易吸潮，不便于保存。不少學者報道用大孔樹脂純化色素效果較好。趙彥杰[9]以龍葵果為原料，研究了5種不同樹脂對龍葵果紅色素的吸附率和解吸效果，及不同洗脫劑的洗脫效果，結果表明AB-8樹脂對龍葵果色素的吸附和解吸效果較好，用體積分數50%乙醇洗脫100 min得到的產品質量較好，樹脂法提取的龍葵果色素色價為35，產品收率為12.6 g/kg。徐亞維等[10]以龍葵果為原料，以吸附和解吸效果為研究指標，對比分析了5種不同樹脂分離純化龍葵果中花青素的試驗效果，并檢測了溫度、吸附時間、流速對吸附效果的影響，以及溫度、洗脫劑濃度、洗脫劑用量對解吸效果的影響。通過對比，篩選出AB-8樹脂最適合分離純化龍葵果中的花青素，最佳吸附和解吸條件為：最佳吸附溫度為35℃，最佳吸附時間為6 h，最佳的流速為2 mL/min，最佳解吸溫度為30℃，最佳乙醇濃度為70%，最佳乙醇用量為9倍體積。騰飛等[11]考察了9種大孔樹脂和2種離子交換樹脂對龍葵果花色苷的靜態吸附和解吸附性能進行研究，得出最佳的純化樹脂為X-5大孔樹脂。通過動態吸附得出最佳純化工藝為：層析柱徑長比為1∶25，最大上樣量為0.6 BV，洗脫劑體積為3.5 BV，上樣濃度為0.4 mg/mL，用pH 2.0的體積分數60%乙醇做洗脫劑，最適流速為2.0 BV/h。X-5樹脂對龍葵果花色苷的純化效果較好，純化后的純度為純化前的19倍。

大孔樹脂法精制龍葵果色素工藝簡單，載樣量大，再生容易，所得色素純度較高，適合工業化生產，具有很好的應用前景。

1.3 穩定性研究

1.3.1 光、溫度、空氣、放置時間對色素穩定性的影響

劉良等[12]研究了光、溫度、放置時間對龍葵果色素穩定性的影響，試驗顯示光照10 d色素下降18.67%，30 d下降51%，其λmax527 nm不變，εmax值隨光照時間的延長而逐漸下降。色素在pH 4水溶液中20、40、80、100℃下加熱 1 h，色素的 λmax527 nm 不變，εmax隨溫度的升高而逐漸下降，80℃下降20.2%，100℃下降48.0%。色素在-2℃～5℃暗處放置18個月λmax527 nm不變，εmax值6個月下降6.2%，12個月下降10.2%，放置18個月下降20.4%，色素εmax值平均每月以1.33%的緩慢速度下降，其色價半衰期約為3年8個月。表明龍葵果色素在低溫避光處放置較長時間有較好的穩定性。劉志明等[4]用陽光和日光燈連續照射龍葵果色素液。隨著光照時間的延長，色素液吸光度值先呈下降趨勢，后又上升，最后由鮮艷的亮紫紅色變為渾濁的深紅色，色素液底部有白色沉淀，過濾后恢復原色。表明長時間光照對該色素有嚴重的不良影響。將龍葵果色素液直接接觸并混入空氣，避免受熱和光直照，間隔適當時間測吸光度值。隨著時間的延長，色素吸光度值呈上升趨勢，原液由澄清的亮紫紅色變為深紫色，渾濁，有沉淀，過濾后恢復原色。表明龍葵果色素長時間充分接觸空氣有嚴重的不良影響。該作者[13]還進一步研究了龍葵果色素提取液在隔離空氣、避光條件下不同溫度時的熱降解情況，總結色素的熱降解化學動力學規律。結果表明，其熱降解屬于一級動力學反應，降解反應的半衰期隨溫度的升高指數性降低，反應速率常數則指數性增大，熱降解半衰期隨溫度升高變化很大。具體數值是龍葵果色素在40℃以下半衰期大于100 h，很穩定；當溫度從40℃升至80℃，色素半衰期縮短約20倍，速率常數也增大約20倍；45℃時半衰期為44.4 h，仍較穩定；60℃時半衰期僅為20.4 h，較不穩定，色素熱降解速率明顯加快；70℃以上半衰期小于8.3 h，穩定性很差。這一熱降解規律與徐雅琴等[14]的研究結果基本一致。騰飛等[15]研究表明在pH 1.0、溫度60℃時，龍葵果花色苷粗提物的穩定性較好，半衰期為37.27 h，反應活化能為101.47 kJ/mol。將龍葵果花色苷降解動力學參數與其他來源的花色苷降解動力學參數相比，發現龍葵果花色苷的穩定性強于樹莓花色苷和藍靛果花色苷，弱于黑米和草莓花色苷。

1.3.2 pH值對色素穩定性的影響

曹熙敏等[16]研究表明當pH值在1～3時，龍葵果紅色素具有明顯的特征吸收峰，隨著溶液pH值的降低，溶液的顏色由淺紅色向深紅色轉變，在532 nm波長處的吸光值顯著增加，說明酸性增強對溶液顏色具有明顯的增色效應；當pH值在4～6時，色素溶液的最大吸收波長均增大，且波峰越來越不明顯，顏色變為淡粉色；當pH=7時，溶液變為紫粉色；pH=8時，溶液變為藍紫色，在可見光區域內無明顯的特征吸收峰。pH值對龍葵果紅色素溶液的顏色影響很大，具有典型的花色苷性質，其溶液在低pH值時呈較強的紅色，隨pH值的升高，溶液的紅色色調逐漸變淺，并產生紫色色調，近中性及堿性時呈現紫粉色和淺藍紫色。龍葵果紅色素溶液在酸性條件下24 h內的顏色變化不明顯，色澤艷麗。劉良等[17]研究表明龍葵果紅色素在水和乙醇溶液中，pH 1～5條件下最穩定，pH 8～14最不穩定。

1.3.3 金屬離子對色素穩定性的影響

曹熙敏等[16]考察6種常見金屬離子對龍葵果色素穩定性的影響。向色素溶液中加入Cu2+和A13+后，色素溶液吸光值明顯增大，溶液紅色加深，說明Cu2+和A13+對色素有一定的增色作用，且離子濃度越大，增色作用越明顯。色素溶液中加入Na+、Mg2+和Ca2+后，肉眼觀察不到色素溶液顏色的變化，表明對色素無明顯影響。當色素溶液中加入Fe3+后，色素溶液變為淺黃色，無沉淀生成，吸光度明顯下降，說明Fe3+對色素分子結構有明顯的破壞作用，并且Fe3+濃度越大，對色素的破壞程度越高。徐雅琴等[18]報道分別配制不同濃度的SnCl2·2H2O的色素液，龍葵果色素液由玫瑰紅變成紫色，且有沉淀物產生，濃度愈大，沉淀愈多。離心后，在440 nm～600 nm波長范圍內的測定吸光值，發現吸光值比對照的降低且最大吸收波長發生變化，向長波方向移動，由此說明色素的結構發生改變，Sn2+對色素有嚴重不良影響。

1.3.4 食品添加劑對色素穩定性的影響

劉良等[17]研究二氧化碳、甜味劑、羧甲基纖維素等對龍葵果色素穩定性影響。向龍葵果色素的pH 4水溶液中分別通入二氧化碳，加入蔗糖、甜蜜素、檸檬酸、羧甲基纖維素放置觀察溶液變化情況。結果表明蔗糖、甜蜜素、二氧化碳、檸檬酸、羧甲基纖維素對龍葵色素無影響，放置3 d其溶液仍呈玫瑰紅色透明溶液，無任何變色和渾濁現象。曹熙敏等[16]研究表明蔗糖、葡萄糖對龍葵果色素溶液無不良影響，濃度較高時還表現出一定的護色和增色效應。防腐劑苯甲酸鈉對色素穩定性有一定影響。低濃度的苯甲酸鈉對色素的影響較小，高濃度的苯甲酸鈉濃度可加速色素的降解。

1.3.5 氧化劑和還原劑對色素穩定性的影響

徐雅琴等[18]報道配制不同濃度 H2O2，Na2SO3·7H2O的色素液，隨著 H2O2，Na2SO3·7H2O 濃度的增大，色素液由玫瑰紅變為淡紅繼而變為無色（或淡黃色）。經測定400 nm～560 nm范圍內吸光，發現最大吸收峰消失，且吸光度隨著濃度增大而迅速下降，表明H2O2和Na2SO3·7H2O能加快龍葵果色素的降解。

綜上所述，龍葵果色素在pH值較高的酸性環境中穩定。雖然龍葵果色素具有一定的光穩定性和熱穩定性。但溫度超過60℃、長時間加熱對色素破壞較大，陽光直射加速色素降解。一般的食品添加劑和防腐劑對其穩定性無明顯影響。一些金屬離子如鋁、銅離子等能與色素分子發生絡合作用起到增色效果，但鐵離子對色素有不良影響。在實際應用中龍葵果色素適用于冷加工食品著色，或做成酸性飲料，可添加低濃度的苯甲酸鈉，最好避光保存，避免接觸鐵質容器，避免接觸氧化劑和還原劑。

1.4 急性毒性研究

羅永華等[19]通過采用急性毒性、Ames、小鼠骨髓細胞微核、小鼠精子畸形和大鼠90 d喂養試驗，對龍葵果紅色素安全性進行了評價，結果表明，龍葵果紅色素急性毒性經口試驗LD50大于6 000 mg/kg，達到了普通食品無毒級標準（1 500 mg/kg）的4倍以上，表明該樣品無急性毒性；Ames試驗、骨髓細胞微核試驗、精子畸形試驗3項遺傳毒性試驗結果均為陰性，表明該色素無遺傳毒性；大鼠90 d喂養試驗各項數據結果均顯示該色素屬于無毒級。

2 龍葵果生物堿研究進展

未成熟的龍葵果中含生物堿、皂苷、多糖類成分，其中甾體生物堿澳洲茄邊堿、澳洲茄堿含量最高[20]。不少學者研究了生物堿的提取純化方法及抗腫瘤活性，以期開發成新的抗腫瘤藥。

2.1 提取純化工藝研究

么宏偉等[21]對龍葵果總生物堿提取進行研究，分別采用回流提取法、微波提取法、超臨界CO2流體萃取三種不同方法從龍葵果中提取總生物堿。對回流提取法中提取時間、提取溫度、料液比3個因素進行了正交試驗和分析，確定提取的最佳工藝參數為提取溫度80℃、料液比為1∶80、提取5 h；對微波輔助技術提取工藝進行了優化，結果表明在微波溫度30℃、乙醇濃度為60%、微波提取60 min的條件下進行提取，總生物堿提取率最高；對CO2萃取法中萃取時間、萃取溫度、萃取壓力3個因素進行了正交試驗和分析，確定CO2萃取的最佳工藝參數為萃取溫度50℃、萃取壓力30 MPa、萃取時間100 min。3種方法中微波提取法得到的總生物堿最多，為最佳提取方法。胡淑曼等[22]利用響應面法優化龍葵中澳洲茄邊堿的提取工藝。采用單因素實驗結合Box-Behnken中心組合設計，以澳洲茄邊堿提取率為指標，考察乙醇體積分數、提取時間、料液比等因素對提取效果的影響。確定龍葵中澳洲茄邊堿的最優提取工藝為：乙醇體積分數80%、提取時間2.1 h、料液比 1 ∶12（g/mL）、提取 2 次，在此條件下，澳洲茄邊堿提取率為0.721 mg/g，與理論值（0.712 mg/g）相符，表明工藝可行，預測性較好。張威等[23]通過星點設計-效應面法優化龍葵生物堿提取工藝。考察提取液中95%乙醇含量、提取溫度和提取時間等不同因素對澳洲茄堿提取率的影響，經運用DPS軟件處理，選用3次多項式模型描述考察指標和3個考察因素之間的數學關系，繪制效應面，確定最佳提取工藝參數：95%乙醇體積分數為73.6%，提取溫度為60℃，提取時間為63.3 min，澳洲茄堿提取率預測值為0.683 mg/g，驗證值為0.676 mg/g。驗證結果表明所建立的數學模型具有良好的預測性，所選工藝條件重現性較好。高小棠等[24]以生物堿提取得率為考察指標，分別用不同比例的乙醇-水和甲醇-水作為溶劑提取龍葵果生物堿，得出80%乙醇為較好的提取溶劑。以80%乙醇為提取溶劑，設不同提取溫度、提取時間、提取料液比3個單因素試驗，再運用全因子試驗設計、最陡爬坡試驗和中心組合試驗進行響應面分析，探索龍葵果生物堿最優提取純化工藝。結果表明：最優龍葵果生物堿的提取工藝條件為提取溫度57.5℃，料液比（1∶20.5）g/mL，提取時間4 h，龍葵果生物堿提取得率為（0.824±0.001）mg/g；通過靜態吸附和解吸篩選出龍葵果生物堿的最佳純化樹脂為AB-8，最佳純化條件為上樣濃度 0.03 mg/mL，上樣 pH 9，徑長比 1 ∶10，用 3.0 BV、pH 3的70%乙醇以2.0 BV/h的流速洗脫，可使生物堿純度提高9.44倍。王妍等[25]揭示龍葵果實用90%乙醇提取，提取物濃縮后用陽離子交換樹脂層析，用含堿乙醇洗脫，回收洗脫液進行濃縮，離心分離得沉淀物，水洗滌至近白色得提取物，其中含澳洲茄堿、澳洲茄邊堿、刺茄堿三者總量為80%～99%。

2.2 抗腫瘤作用研究

日本學者[26]從未成熟的龍葵漿果中分離得到澳洲茄邊堿，澳洲茄堿。它們在濃度15 μg/mL時對人子宮癌細胞株JTC-26的增殖抑制作用分別為100%，97.9%，100%。唐朝輝等[27]利用 3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽 [3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT]實驗法篩選澳洲茄邊堿對6種腫瘤細胞株的體外生長抑制作用，并研究其對肝癌H22和EAC小鼠移植瘤的作用。結果顯示澳洲茄邊堿體外對6株腫瘤細胞均具有較強的抑制作用，其中對人肝癌細胞HepG2活性最強，其IC50為10.51 μmol/L，提示澳洲茄邊堿可能對肝癌細胞較敏感。澳洲茄邊堿以2.4 mg/kg靜脈注射給藥，對肝癌H22和EAC小鼠移植瘤均具有明顯的抑制作用。李明慧等[28]研究表明龍葵甾體類生物堿不僅對S180及Lewis肺癌移植瘤小鼠具有抑制腫瘤增長的作用，還可以顯著提高荷瘤小鼠血清TNF-α、IL-2、IL-6、IL-8的水平，對腫瘤的治療具有積極意義。

3 前景展望

龍葵果野生資源豐富，易栽培。其成熟果實中色素提取純化工藝簡單，安全性高，無毒副作用，是一種值得開發的天然食用色素資源。其未成熟果實中生物堿含量高，提取純化工藝重復性好，體內外抗腫瘤活性強，具備開發成抗腫瘤新藥的潛質。目前對龍葵果色素和生物堿的相關報道都還處在實驗室階段的探索工作，今后需要進行更深入系統地研究。由于花青素類色素的穩定性易受溫度、光照、氧氣、pH值、金屬離子等因素影響，這些特性一定程度上會限制其應用。在食品加工、運輸和儲藏過程中可以采取多種保護措施來提高色素穩定性，如選擇合適的pH值范圍，采用密封避光、低溫流通、充氮保存、開發專用包裝材料等。生物堿活性雖好，但其毒理作用及藥代動力學還需充分研究便于開發成制劑。總之，充分研究和利用龍葵果資源，將會產生巨大的經濟效益和社會效益。

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