正交設計法優化提取田菁葉片蛋白工藝研究

周夢婷，陳子云，杜照奎，3，*，周斌，余敏

（1.臺州學院生命科學學院，浙江臺州318000；2.浙江省鎮海中學，浙江寧波315200；3.浙江省植物進化生態學與保護重點實驗室，浙江臺州318000；4.浙江百花園林集團有限公司，浙江臺州318050）

田菁Sesbania cannabina（Retz.）Poir為豆科田菁屬一年生草本植物，又名堿菁、澇豆，喜溫暖的氣候，常見于我國南方省市[1]。田菁有較強的抗旱能力[2]，同時也耐鹽[3-4]、耐堿[5]、耐澇[6-7]、耐瘠薄[8-9]、耐重金屬[10]，適應性廣。長期以來，田菁一直作為改良鹽堿土和培肥土壤的先鋒綠肥作物[11]。

田菁生長迅速、生物量大，蛋白質含量十分豐富，可作牧草配合飼料飼養動物[12]。此外，一般的豆類蛋白質和谷類蛋白質相比較，更易消化吸收，更加健康符合人類需求[13]，且含多種維生素及礦物質[14]，也可作為人類飲食的蛋白質補充，可改善膳食結構。目前，對于田菁蛋白質分離提取的研究鮮有報道，因而其蘊含的豐富蛋白質并未得到充分利用。本研究以田菁葉片為原料，采用單因素試驗和正交試驗研究其蛋白質提取的最佳工藝條件，旨在提高田菁的資源利用率，為進一步開發利用田菁資源提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 田菁葉片粉末的制備

田菁葉片采自臺州學院椒江校區校園內，80℃干燥8 h后用粉碎機粉碎成粉末，所得粉末用廣口瓶收集，密封置于陰涼處備用。

1.2 標準曲線的測定

稱取10 mg的牛血清白蛋白固體（BSA）加蒸餾水定容至100 mL，此溶液即為試驗所用的0.1 mg/mL標準溶液。在6支試管中加入0.1 mg/mL的標準溶液各0、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL，再依次加入蒸餾水 1、0.8、0.6、0.4、0.2、0 mL。再分別加入3 mL考馬斯亮藍G-250試劑并蓋塞混勻。放置2 min后，在595 nm下比色，繪制標準曲線[15]。以蛋白質濃度（x）對吸光度（y）作出相應的標準曲線，得到線性回歸方程：y=8.533 1x-0.008 0（R2=0.991 4），結果表明總蛋白濃度在0.01 mg/mL～0.1 mg/mL范圍內與吸光度有良好的線性關系。

1.3 單因素試驗對田菁葉片蛋白提取條件的優化

1.3.1 提取時間對田菁葉片蛋白質提取率的影響

準確稱取1 g田菁葉片粉末，置于潔凈燒杯中，按1：30（g/mL）的料液比加水（pH 值為 6），再加入 NaCl粉末，使其濃度為4%，于50℃水浴鍋中分別提取30、60、90、120、150、180 min。提取液于 6 000 r/min 轉速下離心10 min，取上清液1mL置具塞玻璃試管中，加入考馬斯亮藍試劑3 mL，并蓋上塞子，混勻，于波長595 nm處測定吸光度，根據標準曲線計算1 mL提取液和總體積提取液中蛋白質含量。

1.3.2 pH值對田菁葉片蛋白質提取率的影響

準確稱取1 g田菁葉片粉末，置于潔凈燒杯中，按料液比 1 ∶30（g/mL）分別加水，pH 值分別為 2、4、6、8、10、12，再加入NaCl粉末，使其濃度為4%，于50℃水浴鍋中提取90 min。提取液于6 000 r/min轉速下離心10 min，取上清液1 mL置具塞玻璃試管中，其余操作同上。

1.3.3 料液比對田菁葉片蛋白質提取率的影響

準確稱取1 g田菁葉片粉末，置于潔凈燒杯中，分別按料液比 1 ∶10、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50（g/mL）比例加水（pH值為6），再加入NaCl粉末，使其濃度為4%，于50℃水浴鍋中提取90 min。提取液于6000r/min轉速下離心10 min，取上清液1 mL置具塞玻璃試管中，其余操作同上。

1.3.4 提取溫度對田菁葉片蛋白質提取率的影響

準確稱取1 g田菁葉片粉末，置于潔凈燒杯中，按1∶30（g/mL）的料液比加水（pH 值為 6），再加入 NaCl粉末，使其濃度為 4%，分別于 30、40、50、60、70、80 ℃水浴鍋中提取90 min。提取液于6 000 r/min轉速下離心10 min，取上清液1 mL置具塞玻璃試管中，其余操作同上。

1.3.5 鹽濃度對田菁葉片蛋白質提取率的影響

準確稱取1g田菁葉片粉末，置于潔凈燒杯中，按料液比 1∶30（g/mL）比例加水（pH 值為 6），再加入 NaCl粉末，使其濃度分別為1%、2%、3%、4%、5%、6%，于50℃水浴鍋中提取90 min。提取液于6 000 r/min轉速下離心10 min，取上清液1 mL置具塞玻璃試管中，其余操作同上。

1.3.6 正交設計法優化田菁葉片蛋白的提取條件

在提取時間、pH值、液料比、溫度和鹽濃度5個單因素試驗的基礎上，采用五因素四水平進行L16（45）正交試驗，每個試驗重復6次，以確定田菁總蛋白提取的最佳方案，因素水平如表1所示。

1.3.7 數據處理

運用SPSS 13.0對蛋白提取量進行數據分析，并采用Duncan新復極差檢驗法對提取量進行多重比較（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果分析

2.1.1 提取時間對田菁葉片蛋白質含量的影響

提取時間對田菁葉片蛋白質含量的影響見圖1所示。

由圖1可知，蛋白質含量隨著提取時間的增加先增加后降低，當提取時間為90 min時，蛋白質含量達到最高，蛋白質含量為28.98 mg/g，之后含量緩慢下降。可能的原因是提取時間過短，蛋白質還沒有完全從原料中溶解出來；時間過長，高溫和強堿作用會使蛋白質氫鍵斷裂，空間結構遭到破壞，疏水基團暴露、溶解度降低[16]。綜合產量和能耗兩方面原因考慮，初步確定提取時間90 min～180 min。

圖1 提取時間對田菁葉片蛋白質含量的影響Fig.1 Effects of extraction time on extraction yield of Sesbania leaf proteins

2.1.2 pH值對田菁葉片蛋白質含量的影響

pH值對田菁葉片蛋白質含量的影響見圖2所示。

圖2 pH值對田菁葉片蛋白質含量的影響Fig.2 Effects of pH on extraction yield of Sesbania leaf proteins

由圖2可知，蛋白質含量隨著pH值的增加先顯著增加，到pH=6時，含量最大，值為32.51 mg/g；隨后，蛋白質含量隨pH值的升高而顯著降低。這是因為蛋白質為兩性電解質，在某一pH值的溶液中它所帶的正電荷數與負電荷數恰好相等，即凈電荷數為零（此時pH值稱為等電點），等電點時蛋白質間靜電斥力最低，蛋白質溶解度最低，容易聚集、沉淀，從溶液中析出[17]；而較強的酸或堿會使蛋白質脫氨、脫羧或水解，使得含量降低[18]。據此，初步確定提取pH值范圍為4～10。

2.1.3 料液比對田菁葉片蛋白含量的影響

料液比對田菁葉片蛋白含量的影響見圖3所示。

由圖3可知，當料液比較大時，蛋白質含量隨料液比增大而顯著增加，料液比達到1∶30（g/mL）時，產量達到峰值，蛋白質含量為35.12 mg/g，之后又顯著下降?？赡芤驗楫斎軇┝刻r，田菁葉片蛋白不能完全充分溶解，溶液中的蛋白質少，所以含量過小，但是加溶劑量過大，則又會破壞提取效果[19]，而且使試驗設備體積增大，大大降低了生產效率。因此，初步確定提取的料液比為 1∶20（g/mL）～1∶50（g/mL）。

圖3 料液比對田菁葉片蛋白質含量的影響Fig.3 Effects of material-to-liquid on extraction yield of Sesbania leaf proteins

2.1.4 提取溫度對田菁葉片蛋白質含量的影響

提取溫度對田菁葉片蛋白質含量的影響見圖4所示。

圖4 提取溫度對田菁葉片蛋白質含量的影響Fig.4 Effects of extraction temperature on extraction yield of Sesbania leaf proteins

由圖4可知，葉片蛋白含量隨提取溫度的升高而顯著增加，當提取溫度達到50℃時，蛋白質產量達到最高值30.35 mg/g。這是因為溫度升高，分子運動速度加快，蛋白質較容易從原料中溶解出來，但溫度不是越高越好，高溫會使蛋白質變性或裂解[20]，從而影響蛋白質的含量和質量。綜合能耗和產量考慮，初步確定提取溫度為30℃～60℃。

2.1.5 鹽濃度對田菁葉片蛋白質含量的影響

鹽濃度對田菁葉片蛋白質含量的影響見圖5所示。

由圖5可知，當鹽濃度為1%～5%時，葉片蛋白質含量基本符合逐步上升的趨勢，當鹽濃度為5%時，葉片蛋白值含量達到最高34.68 mg/g，超過5%后，提取含量有所下降。這可能是因為溶液中的鈉離子和氯離子可與帶負電荷和正電荷的蛋白質基團結合，屏蔽了蛋白質分子之間的靜電排斥力，蛋白質分子在運動時更容易交聯、聚焦而產生沉淀析出[21]。綜合含量和成本因素，初步確定鹽濃度為2%～5%。

圖5 鹽濃度對田菁葉片蛋白質含量的影響Fig.5 Effects of the concentration of NaCl on extraction yield of Sesbania leaf proteins

2.2 正交設計法優化提取工藝

2.2.1 正交試驗結果

根據單因素的結果，設計L16（45）五因素四水平正交優化試驗，每個試驗重復6次，結果見表2。

表2正交設計及結果L16（45）Table 2L16（45）orthogonal design arrangement and experimental results

從表2可以看出，根據極差R的大小判斷得：田菁葉片蛋白質提取含量影響因素的主次順序為D＞A＞C＞E＞B，即提取溫度＞提取時間＞料液比＞鹽濃度＞pH值。分析蛋白質提取的含量和各因素的k值，A2B3C4D4E3組合為田菁葉片蛋白質提取的最佳方案。

2.2.2 正交試驗方差分析和多重比較結果

為考察5種因素對蛋白質提取含量的差異，采用One-Way ANOVA進行單因素方差分析，結果見表3。

表3 正交試驗方差分析結果Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments

由表3可知，因素A和D不同水平之間有顯著性差異，說明提取溫度和提取時間對田菁葉片蛋白質的提取率有顯著影響；因素B、C和E均無顯著性差異，說明pH值、料液比和鹽濃度在正交設計的4個水平對蛋白質的提取率無顯著影響。

為了進一步考察顯著因素不同水平間的差異，采用Duncan新復極差法分別對因素A和D進行多重比較，結果見表4。

表4 A和D兩因素四水平蛋白提取量均值的多重比較Table 4 Multiple comparisons of proteins extraction yield at different levels of factor A and D

由表4可知，A2和A3水平對蛋白質含量的影響顯著高于A1水平，但A2和A3之間差異不顯著，而選擇A2水平成本更低；D4水平顯著高于D2和D1水平，故選擇D4作為D因素的最適水平。

因素B、C和E因無顯著性差異，其水平可根據實際情況進行選擇。從經濟角度考慮，三者分別B3、C1和E1均較為合適。因此，最后確定提取田菁葉片蛋白質的最佳工藝參數為A2B3C1D4E1，即采用料液比1∶20（g/mL）、pH 8、NaCl 2%、60℃條件下提取120 min，即可達到最佳提取效果，在此條件下重復提取田菁葉片蛋白質6次，測得平均提取率為40.02 mg/g。

3 結論

以水為溶劑，從田菁葉中提取蛋白質，得到影響蛋白質提取率的各個因素主次為提取溫度、提取時間、料液比、鹽濃度和pH值。從田菁葉中提取蛋白質的最佳工藝條件為：料液比 1 ∶20（g/mL）、pH 8、NaCl 2%、提取溫度60℃，提取時間120 min。按該工藝參數組合提取田菁葉片蛋白質的提取率可達40.02 mg/g。

[1]張曉紅,鄒長明,王允青,等.適宜在安徽推廣種植的田菁品種的篩選與評價[J].湖南農業大學學報(自科版),2015,41(2):190-195

[2]Srivastava N,Kumar G.Influence of drought stress on cytological behavior of green manure crop Sesbania cannabina Poir[J].Cytologia,2014,79(3):325-329

[3]Ren C G,Bai Y J,Kong C C,et al.Synergistic interactions between salt-tolerant rhizobia and arbuscular mycorrhizal fungi on salinity tolerance of Sesbania cannabina Plants[J].Journal of Plant Growth Regulation,2016,35(4):1098-1107

[4]張立賓,郭新霞,常尚連.田菁的耐鹽能力及其對濱海鹽漬土的改良效果[J].江蘇農業科學,2012,40(2):310-312

[5]Rao D L N,Gill H S.Biomass and biofertilizer production by Sesbania cannabina in alkaline soil[J].Bioresource technology,1995,53(2):169-172

[6]Li Y,Li X,Liu Y,et al.Genetic diversity and community structure of rhizobia nodulating Sesbania cannabina in saline-alkaline soils[J].Systematic and applied microbiology,2016,39(3):195-202

[7]謝文軍,王濟世,靳祥旭,等.田菁改良重度鹽漬化土壤的效果分析[J].中國農學通報,2016,32(6):119-123

[8]張俊彪,謝秒秒,張磊,等.田菁莖瘤固氮根瘤菌ORS571類T3SS效應蛋白的預測、原核表達及相關功能分析[J].農業生物技術學報,2017,25(3):461-469

[9]姜南,劉衛,李巖,等.莖瘤固氮根瘤菌趨化系統基因的比較基因組學分析及相關蛋白序列分析[J].微生物學報,2016,56(8):1256-1265

[10]Sinha S,Gupta A K.Translocation of metals from fly ash amended soil in the plant of Sesbania cannabina L.Ritz:effect on antioxidants[J].Chemosphere,2005,61(8):1204-1214

[11]秦俊豪,溫瑩,李君菲,等.綠肥植物田菁的化感效應及對土壤肥力的影響[J].土壤,2015,47(3):524-529

[12]李福嶺.田菁的飼料利用價值及飼喂試驗[J].飼料研究,1993(5):30-31

[13]張艷,朱珠,張傳智,等.黑豆餅粕蛋白的超聲波提取及其性質的研究[J].食品研究與開發,2014,35(24):49-53

[14]張亞格,李茂,周漢林,等.豆科牧草在肉羊生產中的應用[J].家畜生態學報,2016,37(5):73-77

[15]葉婧,曾育蒙,王秀麗,等.腰果蛋白的提取及功能特性研究[J].食品研究與開發,2016,37(6):43-49

[16]楊芙蓮,趙麗娜.甜蕎麥麩皮蛋白質提取工藝研究[J].陜西科技大學學報(自然科學版),2015,35(1):126-130

[17]劉宇,劉暢,楊杰,等.橡膠籽分離蛋白的組成及功能性質[J].中國糧油學報,2016,31(5):61-65

[18]孔維寶,侯明杰,李萬武,等.文冠果油渣中蛋白質的提取工藝研究[J].中國油脂,2014,39(7):42-45

[19]楊曉明,安峰峰,張雅倩.三葉草可溶性蛋白提取工藝研究[J].甘肅科技,2014,30(23):146-148

[20]趙晨霞,祝海娟,張翌楠.正交試驗優化大麥蟲蛋白質提取工藝[J].食品科學,2013,34(16):42-45

[21]邵瑤瑤,趙燕,徐明生,等.金屬離子對蛋白質凝膠化行為的影響研究進展[J].食品科學,2017,38(5):299-304