響應面優化超聲輔助NaOH/氨水預處理甘蔗渣

崔媛媛，許琳琳，鄭文靜，劉容，孫衛東

（廣西大學輕工與食品工程學院，廣西南寧530004）

甘蔗渣來源廣、產量大，是一種優質的可再生生物資源，其開發利用受到科研人員的關注。利用甘蔗渣生產高附加值的產品已經成為研究熱點。甘蔗渣主要成分是半纖維素（19%～24%）、木質素（23%～32%）、纖維素（32%～48%）[1]。相對一般農作物秸稈比較農藥殘留量比較低，但木質化程度相對較高[2]。由于科學技術手段限制，甘蔗渣通常只用做燃料，其利用率很低造成了環境的污染和資源的浪費。因為蔗渣的木質化程度高、蔗莖表皮存在硅化細胞，養分不協調等原因，作為反芻動物飼料和栽培菌類都受到限制[3]。

甘蔗渣等木質纖維素原料來源豐富、產量可觀、性質穩定，從經濟角度看，如果所有成分可以完全進行分級分離并用于生產，它的高效和合理利用可以達到一個理想狀態。蔗渣中的纖維素成分可以分解形成各種各樣的產物如纖維二糖、纖維糊精、葡萄糖等[4]，還可以進一步發酵生成乙醇等生物燃料，實現糖和乙醇之間的轉化[5]。甘蔗中的半纖維素是以阿拉伯木聚糖形式為主。木聚糖分子的完全酶解，首先是β-1，4-木聚糖酶作用于木聚糖分子內部的糖苷鍵將其水解成低聚木糖[6]，然后β-木糖苷酶開始作用于低聚木糖的尾端，可最終釋放出木糖[7]。木糖經過發酵生成木糖醇。木糖醇具有良好的理化性質，廣泛地被應用于食品、醫藥、化工等領域。蔗渣中的木質素其被證實有抗氧化性、抗菌性、殺蟲特性，可以作為食品工業潛在的抗氧化劑[8]。

蔗渣的預處理和酶解糖化已經成為研究的熱點，如何有效地使甘蔗渣生成可發酵糖是問題的關鍵[9]。蔗渣是典型的木質纖維素原料，結構中纖維素、半纖維素、木質素結合緊密，在利用甘蔗渣酶解生產木糖之前需要對其進行預處理，破壞致密結構，有利于化學試劑和酶的結合。蔗渣等木質纖維素的原料的預處理方法一般分為物理法，化學法，生物法，物理化學結合法[10]。有機試劑如甘油用作預處理蔗渣，可以促進蔗渣的快速熱解[11]。蒸汽爆破、微波處理、超聲波處理、高溫分解等物理方法在木質纖維原料的預處理應用方面也都有大量的研究。物理化學結合法已成為眾多學者所研究探討的預處理方法。例如王淋靚等[12]使用超聲輔助堿性雙氧水法預處理甘蔗渣，舒雪梅等[13]采用了超聲波輔助堿預處理對甘蔗渣，兩者都證明了物理化學法的結合預處理甘蔗渣提高了蔗渣纖維對試劑的可及度和反應性能。本文采用單因素方法，考察影響超聲波輔助NaOH/氨水混合堿液預處理酶解甘蔗渣的因素，在單因素的基礎上，用響應面法優化了超聲波輔助NaOH/氨水混合堿液預處理酶解甘蔗渣的工藝。

1 材料和方法

1.1 材料和儀器

蔗渣原料取自于廣西防城港市糖廠，機械粉碎，過80目篩，備用。

氫氧化鈉、氨水、氫氧化鉀、鹽酸、冰乙醇、木糖標準品：均為國產分析純；木聚糖酶（100 000 IU/g）：sigma公司；間苯三酚：國產化學純。

電動中草藥粉碎機（WK-800A）：青州市精誠機械有限公司；電子天平（TLE204）：梅特勒-托利多儀器有限公司；數控超聲波清洗機（KQ-500DE）：昆山市超聲儀器有限公司；紫外可見分光光度計（UV-1100）：上海美普達儀器有限公司；pH計（PHS-3E）：上海儀電科學儀器股份有限公司；數顯恒溫振蕩器（SHA-CA）：常州普天儀器制造有限公司；電熱恒溫鼓風干燥箱（DHG-9070A）：上海鴻都電子有限公司；低速自動平衡離心機（L550）：長沙湘儀離心機儀器有限公司；循環水式多用真空泵（SHB-Ⅲ）：鄭州長城科工貿有限公司；電熱恒溫水浴鍋（HH-4）：國華電器有限公司。

1.2 試驗方法

木糖濃度測定：間苯三酚法測定木糖濃度。具體方法：蔗渣預處理酶解后離心抽濾，適當稀釋后取1 mL，加入5 mL間苯三酚顯色劑，搖勻后沸水浴顯色8 min，流水冷卻至室溫后于波長554 nm下測定吸光度，以蒸餾水為空白調零[13]。由標準曲線計算出木糖濃度[14]。

1.3 單因素試驗

1.3.1 不同NaOH/氨水配比預處理酶解甘蔗渣

稱取1.000 g甘蔗渣于100 mL錐形瓶，分別按照3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3（體積比）比例加入 10%的NaOH和氨水混合堿液20 mL，每一比例3組平行試驗，在溫度為60℃，功率為300 W條件下超聲處理50 min，超聲結束后，調節混合液pH值至5.5，加入木聚糖酶0.050 g，置于恒溫水浴振蕩器中，55℃條件下反應18 h后滅酶活，4 000 r/min離心15 min，抽濾，水解液稀釋適當倍數后比色法測定木糖含量。

1.3.2 不同NaOH/氨水濃度預處理酶解甘蔗渣

稱取1.000 g甘蔗渣于100 mL錐形瓶，按照NaOH和氨水比例為2∶1（體積比）分別加入5%、10%、15%、20%、25%的混合堿液20 mL，每一濃度3組平行試驗，在溫度為60℃，功率為300 W條件下超聲處理50 min，超聲結束后，調節混合液pH值至5.5，加入木聚糖酶0.050 g，置于恒溫水浴振蕩器中，55℃條件下反應18 h后滅酶活，4 000 r/min離心15 min，抽濾，水解液稀釋適當倍數后比色法測定木糖含量。

1.3.3 不同超聲時間預處理酶解甘蔗渣

稱取1.000 g甘蔗渣于100 mL錐形瓶，按照NaOH和氨水比例為2∶1（體積比）加入15%混合堿液20 mL，在溫度為60℃，功率為300 W條件下分別超聲處理 10、20、30、40、50 min，每一超聲時間 3 組平行試驗，超聲結束后，調節混合液pH值至5.5，加入木聚糖酶0.050 g，置于恒溫水浴振蕩器中，55℃條件下反應18 h后滅酶活，4 000 r/min離心15 min，抽濾，水解液稀釋適當倍數后比色法測定木糖含量。

1.3.4 不同超聲溫度預處理酶解甘蔗渣

稱取1.000 g甘蔗渣于100 mL錐形瓶，按照NaOH和氨水比例為2∶1（體積比）加入混合堿液20 mL，分別在溫度為 30、40、50、60、70 ℃，功率為 300 W 條件下超聲處理30 min，每一超聲溫度3組平行試驗，超聲結束后，調節混合液pH值至5.5，加入木聚糖酶0.050 g，置于恒溫水浴振蕩器中，55℃條件下反應18 h后滅酶活，4 000 r/min離心15 min，抽濾，水解液稀釋適當倍數后比色法測定木糖含量。

1.3.5 不同超聲功率預處理酶解甘蔗渣

稱取1.000 g甘蔗渣于100 mL錐形瓶，按照NaOH和氨水比例為2∶1（體積比）加入15%混合堿液 20 mL，溫度為 40 ℃，分別在功率為 120、200、300、400、500 W，條件下超聲處理30 min，每一超聲功率3組平行試驗，超聲結束后，調節混合液pH值至5.5，加入木聚糖酶0.050 g，置于恒溫水浴振蕩器中，55℃條件下反應18 h后滅酶活，4 000 r/min離心15 min，抽濾，水解液稀釋適當倍數后比色法測定木糖含量。

1.3.6 不同固液比對預處理酶解甘蔗渣

稱取1.000 g甘蔗渣于100 mL錐形瓶，分別加入5、10、15、20、25 mL 的 NaOH 和氨水混合堿液，在溫度為40℃，在功率為300 W條件下超聲處理30 min，每一超聲功率3組平行試驗，超聲結束后，調節混合液pH值至5.5，加入木聚糖酶0.050 g，置于恒溫水浴振蕩器中，55℃條件下反應18 h后滅酶活，4 000 r/min離心15 min，抽濾，水解液稀釋適當倍數后比色法測定木糖含量。

2 結果與討論

2.1 不同NaOH/氨水配比對預處理酶解甘蔗渣后木糖濃度的影響

不同NaOH和氨水配比對預處理酶解甘蔗渣后木糖濃度的影響見圖1。

圖1 不同NaOH和氨水配比對預處理酶解甘蔗渣后木糖濃度的影響Fig.1 The effect of ratio of NaOH to ammonia on the xylose concentration of bagasse enzymatic hydrolysate

由圖1所知，隨著NaOH所占比例不斷減小，預處理酶解甘蔗渣后木糖濃度先增加后減小，其中在NaOH和氨水比例為2∶1（體積比）時木糖濃度最大。NaOH和氨水對甘蔗渣結構有潤脹作用，破壞甘蔗渣中半纖維素和木質素之間的醚鍵，同時也能消弱半纖維素和纖維素之間連接的氫鍵，通過皂化半纖維素和木質素之間的酯鍵，從而增大甘蔗渣纖維間的孔隙，使木聚糖酶對半纖維素的可及性增加，從而提高半纖維素的酶解率[15]。但是隨著氨水濃度的增大，半纖維素含量會發生損失，不利于木聚糖酶酶解半纖維素成木糖。所以后續試驗中選定NaOH和氨水的比例為2∶1（體積比）。

2.2 不同NaOH/氨水濃度對預處理酶解甘蔗渣后木糖濃度的影響

不同NaOH和氨水濃度對預處理酶解甘蔗渣后木糖濃度的影響見圖2。

圖2 不同NaOH和氨水濃度對預處理酶解甘蔗渣后木糖濃度的影響Fig.2 The effect of concentration of NaOH and ammonia on the xylose concentration of bagasse enzymatic hydrolysate

如圖2所示，隨著混合堿液濃度不斷增加，甘蔗渣酶水解液中木糖濃度不斷增大，當NaOH和氨水混合堿液濃度為15%時，木糖濃度最高達2.336 g/L。當混合堿液濃度繼續增大，酶水解液中木糖濃度減小，原因是隨著混合堿液濃度增大，潤脹作用破壞甘蔗渣木質纖維素結構的同時，降解半纖維素，不利于木聚糖酶解半纖維素成木糖。甘蔗渣木質纖維素結構中的木質素溶出，會和堿液發生反應生成鹽，不利于預處理酶解甘蔗渣繼續進行[16]。所以在后續試驗中選定混合堿濃度為15%。

2.3超聲時間對預處理酶解甘蔗渣后木糖濃度的影響

超聲時間對預處理酶解甘蔗渣后木糖濃度的影響見圖3。

由圖3所知，隨著超聲時間的增大，甘蔗渣酶水解液中木糖濃度逐漸增大，在30 min時達到最大，超聲時間大于30 min后，木糖濃度開始隨時間的增大而逐漸減小。原因是超聲波輔助堿預處理酶解甘蔗渣，破壞甘蔗渣木質纖維素結構，使其表面出現空隙，使木聚糖酶能更好結合，但是隨著超聲時間的延長，木糖的濃度減小，這可能是由于水解產物抑制木聚糖的降解或者木聚糖酶活性的下降[16]。所以為了得到更好的木糖濃度，后續試驗中選定超聲時間為30 min。

圖3 超聲時間對預處理酶解甘蔗渣后木糖濃度的影響Fig.3 The effect of ultrasonic time on the xylose concentration of bagasse enzymatic hydrolysate

2.4 超聲溫度對預處理酶解甘蔗渣后木糖濃度的影響

超聲溫度對預處理酶解甘蔗渣后木糖濃度的影響見圖4。

圖4 超聲溫度對預處理酶解甘蔗渣后木糖濃度的影響Fig.4 The effect of ultrasonic temperature on xylose concentration of bagasse enzymatic hydrolysate

如圖4所示，隨著超聲溫度的增大，甘蔗渣酶水解液中木糖濃度增加，在40℃達到最大，超聲溫度超過40℃后，木糖濃度開始逐漸減小。原因是超聲溫度的增大，有利于溶液中分子的不斷運動，分子能量增大，增強反應的有效碰撞，同時溫度的升高，有利于混合堿液預處理酶解甘蔗渣，但是超聲溫度過高，甘蔗渣木質纖維素結構中成分發生降解，產生糠醛等不利于后續微生物發酵木糖醇的過程[16]。綜上所述，為了得到較高木糖濃度的酶解發酵液，后續試驗中選定超聲溫度40℃。

2.5 超聲功率對預處理酶解甘蔗渣后木糖濃度的影響

超聲功率對預處理酶解甘蔗渣后木糖濃度的影響見圖5。

由圖5所知，隨著超聲功率的增大，酶水解液中木糖濃度不斷增加，超聲功率為300 W時達到最大，當超聲功率超過300 W后木糖濃度開始減小。原因是超聲波預處理具有熱效應、機械作用和空化作用，可破壞甘蔗渣木質纖維素結構，增大空隙使木聚糖酶更好的分解半纖維素得木糖，當超聲波功率繼續增大，超聲波處理對甘蔗渣微細結構的影響有限，反之，空化泡的生成量空前增多，從而增加了空化泡之間的消能作用，空化泡不能充分崩潰，使半纖維素降解效率下降，反而不利于預處理酶解甘蔗渣的過程[17]。所以為了得到更高的木糖濃度，后續試驗選定超聲功率為300 W。

圖5 超聲功率對預處理酶解甘蔗渣后木糖濃度的影響Fig.5 The effect of ultrasonic power on the xylose concentration of bagasse enzymatic hydrolysate

2.6 固液比對預處理酶解甘蔗渣后木糖濃度的影響

固液比對預處理酶解甘蔗渣后木糖濃度的影響見圖6。

圖6 固液比對預處理酶解甘蔗渣后木糖濃度的影響Fig.6 The effect of different solid-to-liquid ratio on the xylose concentration of bagasse enzymatic hydrolysate

如圖6所示，固液比對超聲波輔助混和堿液預處理酶解甘蔗渣木糖濃度的影響隨著固液比的增大而緩慢增大，但是總體對木糖濃度影響不是很顯著。原因是自由水的含量影響超聲波預處理的傳質作用，自由水流動增強，有利于分子能量的運動和能量的傳遞，但是隨著自由水的增大，固液比不再是影響超聲波輔助混合堿溶液預處理酶解甘蔗渣木糖濃度的因素，結合成本因素，應選擇1∶10（g/mL）的固液比。

2.7 響應面試驗設計及結果

2.7.1 響應面試驗因素及水平的選取

綜合考慮超聲波輔助NaOH/氨水混合堿溶液預處理酶解甘蔗渣的單因素試驗，選取不同NaOH和氨水配比，混合堿溶液濃度，超聲條件（溫度、功率、時間）5個因素進行響應面試驗設計，采用BOX-Behnken的五因素三水平設計，選取因素和水平如表1。

表1 響應面分析實驗因素水平表Table 1 Factors and levels of the response surface design

2.7.2 響應面試驗因素及水平的選取

以木糖濃度為響應值，超聲波輔助NaOH/氨水混合堿溶液預處理酶解甘蔗渣過程按照表2的設計進行了46組試驗。

表2 響應面試驗設計與結果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

續表2 響應面試驗設計與結果Continue table 2 Experimental design and results for response surface analysis

2.7.3 響應面試驗回歸分析和方差分析

利用Design-Expert軟件對表2試驗數據進行擬合，得到二次多項回歸模型為：木糖濃度=2.19+0.034A+0.090B+0.18C-0.025D+0.13E-0.14AB+6.500E-0.04AC-0.078AD-0.041AE+0.033BC-0.092BD+0.068BE-0.19CD-0.013CE-0.30DE-0.30A2-0.36B2-0.23C2-0.40D2-0.036E2（式 1）

對該模型進行方差分析和回歸模型系數顯著性檢驗結果見表3。

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance for the fitted regression model

續表3 方差分析Continue table 3 Analysis of variance for the fitted regression model

由表3所知模型的F值為11.071 2，P值＜0.000 1＜0.05表示該回歸模型極顯著，失擬項P=0.235 1＞0.05，不顯著，R2值為 0.898 5，精確度 10.971 0＞4，即表示模型與實際情況擬合良好，模型準確有效。在該模型有效的情況下，由表3所知，一次項B、C、E的P值都小于0.05，表示混合堿濃度、超聲溫度、超聲時間預處理酶解甘蔗渣后對木糖濃度影響顯著。二次項A2、B2、C2，D2和交互項AB、CD、DE都對木糖濃度影響顯著。

2.7.4 響應面試驗因素交互作用結果分析

根據得到的二次擬合回歸方程，交互項AB、CD、DE都對木糖濃度影響顯著，利用Dinsign-expert軟件做出響應曲面。如圖7所示，3D曲面圖和等高線可以直觀的反映出各個因素的交互作用對木糖濃度的影響，曲面越陡，表明該因素對木糖濃度的影響越顯著顯著，反之曲面越平緩，表明該因素對不木糖濃度影響不顯著。等高線則反映出因素交互作用，趨向橢圓則表示交互作用不顯著。

由圖7a中等高線可知，A-NaOH/氨水的混合堿比例和B-混合堿濃度交互作用顯著，增大混合堿濃度可以減小NaOH/氨水的混合堿比例，同時可以看出混合堿濃度對木糖濃度影響較顯著。圖7b顯示超聲溫度和超聲功率的相互作用對預處理酶解甘蔗渣后木糖濃度的影響，從圖中等高線可知超聲溫度和超聲功率的交互作用顯著。同樣從圖7c可以看出超聲時間和超聲功率的交互作用顯著。

2.7.5 響應面優化最佳工藝參數的驗證試驗

通過軟件分析，得出預處理酶解甘蔗渣最優條件為NaOH和氨水比例為2∶1（體積比），混合堿濃度為17%，超聲溫度為45℃，超聲功率284 W，超聲時間為40 min，根據實際試驗條件，選取NaOH和氨水比例為2∶1（體積比），混合堿濃度為17%，超聲溫度為45℃，超聲功率300 W，超聲時間為40 min，在此條件下重復試驗得出木糖濃度為2.431 0 g/L，與預測理論值2.5 g/L非常吻合，從而說明優化結果是可行的。

3 結論

本文以木糖濃度為指標，考察了NaOH和氨水的配比、混合堿溶液的濃度、超聲溫度、超聲功率、超聲時間、固液比對預處理酶解甘蔗渣后木糖濃度的影響。在單因素試驗的基礎上，選取對酶水解液中木糖含量有影響的主要因素，以木糖濃度為響應值對預處理酶解甘蔗渣方法進行響應面法優化，確定優化條件結果是，NaOH和氨水2∶1（體積比），混合堿濃度17%，超聲溫度為45℃，超聲功率400 W，超聲時間40 min，在此條件下酶水解液中木糖濃度2.431 0 g/L。蔗渣的有效地預處理對于實現蔗渣等木質纖維材料的綜合利用有重要的指導意義，其成分的多級化合理利用有待進一步的探究和推廣。

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