基于蜂蜜中氨基酸的毛細(xì)管電泳指紋圖譜構(gòu)建

毛月慧，畢曉彤，閆師杰，劉翠翠

（天津農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與生物工程學(xué)院，天津300384）

蜂蜜，因其獨(dú)特的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和保健功效，被人們譽(yù)為大自然最完美的營(yíng)養(yǎng)品，深受廣大消費(fèi)者的青睞。近年來(lái)，由于蜂蜜產(chǎn)量供不應(yīng)求，有些企業(yè)為了提高產(chǎn)量經(jīng)常在蜂蜜中勾兌玉米糖漿、大米糖漿、甜菜糖漿、木薯糖漿、蔗糖、飴糖等造假成分[1]。然而，我國(guó)現(xiàn)行的蜂蜜食品安全標(biāo)準(zhǔn)中在蜂蜜辨?zhèn)畏矫娲嬖诼┒矗瑢?dǎo)致不法商販的造假行為屢禁不止，國(guó)內(nèi)蜂蜜行業(yè)遭遇嚴(yán)重的信任危機(jī)。

毛細(xì)管電泳指紋圖譜技術(shù)是利用毛細(xì)管電泳技術(shù)得到的能夠代表該樣品特性的色譜數(shù)據(jù)資料的技術(shù)。目前，在中藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)方面應(yīng)用比較廣泛[2-4]。周賢婧等首次將毛細(xì)管電泳技術(shù)用于蜂蜜中氨基酸含量的測(cè)定，旨在為蜂蜜的蜜源鑒別及質(zhì)量評(píng)估提供借鑒方法。該方法實(shí)現(xiàn)了9種氨基酸的基線分離[5]。然而蜂蜜中氨基酸種類豐富，構(gòu)建蜂蜜中常見(jiàn)氨基酸指紋圖譜必將成為蜂蜜質(zhì)量評(píng)估更為可靠的方法。細(xì)菌纖維素（Bacterial cellulose，BC）是由葡萄糖以 β-1，4-糖苷鍵連接而成的高分子化合物，與植物纖維素相比，BC具有許多獨(dú)特性質(zhì)，比如：超細(xì)網(wǎng)狀纖維結(jié)構(gòu)，比表面積大，氫鍵結(jié)合能力強(qiáng)[6]。BC作為一種具有多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)及一定孔徑分布的新型納米生物材料，目前已有研究報(bào)道以BC為原料制備吸附型濾膜用于大分子蛋白及無(wú)機(jī)重金屬離子的分離[7-8]。這些結(jié)果表明：BC在毛細(xì)管電泳分離領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

本研究針對(duì)消費(fèi)者對(duì)高效、權(quán)威蜂蜜辨?zhèn)渭夹g(shù)的迫切需求，基于毛細(xì)管電泳技術(shù)便捷、高效、快速、樣品用量極小等優(yōu)點(diǎn)[9-10]，結(jié)合指紋圖譜技術(shù)在辨?zhèn)晤I(lǐng)域的應(yīng)用潛力，構(gòu)建蜂蜜中常見(jiàn)的17種氨基酸毛細(xì)管電泳指紋圖譜，并實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確定量，為天然蜂蜜質(zhì)量控制提供新參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

貝克曼P/ACE MDQ毛細(xì)管電泳儀配激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器（Ex 488 nm，Em 520 nm）：美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司；毛細(xì)管（50 μm）：河北永年光纖廠；pH計(jì)：瑞士METTLER-TOLEDO公司；萬(wàn)分之一分析天平：德國(guó)梅特勒公司；單道微量可調(diào)移液器：德國(guó)Eppendorf公司；水系針頭過(guò)濾膜（0.22 μm）：菲羅門科技發(fā)展有限公司；玻璃儀器：天津玻璃儀器廠。

1.2 試劑與材料

BC：海南億德食品有限公司；732陽(yáng)離子交換樹(shù)脂：麥克林試劑公司；17種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品：麥克林試劑公司；異硫氰酸熒光素（Fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）：美國(guó)Sigma公司；鹽酸：天津市化學(xué)試劑一廠；氫氧化鈉（NaOH）：天津光復(fù)精細(xì)化學(xué)研究所；硼砂（Na2B4O7）、磷酸二氫鈉（NaH2PO4）：天津市化學(xué)試劑一廠；實(shí)驗(yàn)用水為二次去離子水。蜂產(chǎn)品包括洋槐蜜、棗花蜜及蜂王漿蜜膏：市售。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 BC處理

市售BC呈片狀，本研究采用酸水解法對(duì)BC進(jìn)行處理[11]。具體操作步驟如下：稱取3 g干燥BC于燒杯，加入150 mL蒸餾水2 500 r/min攪拌勻漿3 min，4000 r/min離心10min。去上清，在沉淀中加入100mL 50%硫酸溶液，50℃水解，5 h后加入500 mL蒸餾水終止反應(yīng)。靜置過(guò)夜，除去上層清液，對(duì)下層產(chǎn)物進(jìn)行離心洗滌直至中性，離心轉(zhuǎn)速10 000 r/min。最后冷凍干燥備用。

1.3.2 溶液配制

1.3.2.1 氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液配制

準(zhǔn)確稱取氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品，用去離子水配成0.1 mmol/L氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2.2 電泳緩沖液配制

由去離子水分別配制不同濃度的Na2B4O7，NaH2PO4溶液；然后，按照需要配制不同pH電泳緩沖液。上儀器前緩沖液需要過(guò)膜超聲處理。

1.3.2.3 FITC丙酮溶液

準(zhǔn)確稱取5.0 mg FITC溶于10 mL丙酮，配成1.3 mmol/L，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 樣品制備

蜂蜜中氨基酸提取采用固相萃取法[12]。①活化：732陽(yáng)離子交換樹(shù)脂由飽和NaCl溶液、1 mol/L NaOH溶液1.5 mol/L鹽酸溶液分別浸泡8 h，最后以去離子水沖至中性并裝柱。②氨基酸吸附：準(zhǔn)確稱取蜂蜜5.0 g，加入40 mL去離子水?dāng)嚢枞芙夂螅名}酸調(diào)節(jié)pH 2.0，過(guò) 732陽(yáng)離子交換樹(shù)脂柱（16 mm×300 mm），流速為1 mL/min。③氨基酸洗脫：以50 mL 2 mol/L氨水洗脫，流速1.0 mL/min，收集氨水部分，50℃蒸干溶劑，用去離子水溶解定容至10 mL。

1.3.4 氨基酸衍生化

取0.1mmol/L氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液1mL，加入1.3 mmol/L FITC 0.1 mL，漩渦震蕩1 min，4℃避光反應(yīng)2 h。

1.3.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

將1.3.4氨基酸衍生物稀釋至所需濃度，進(jìn)樣分析。以氨基酸衍生物濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.6 電泳條件

毛細(xì)管（內(nèi)徑：50 μm；有效長(zhǎng)度 45 cm）使用前分別用1.0 mol/L鹽酸、1.0 mol/L NaOH溶液和去離子水各沖洗3 h；每天實(shí)驗(yàn)前毛細(xì)管用1.0 mol/L鹽酸、0.1 mol/L NaOH溶液、去離子水及分離緩沖溶液各沖洗5 min；兩次運(yùn)行之間，毛細(xì)管依次用0.1 mol/L NaOH沖洗1 min，去離子水沖洗2 min，分離緩沖溶液沖洗3 min。分離電壓25 kV；分離柱溫25℃；壓力進(jìn)樣0.5 psi（34 475 Pa）3 s；運(yùn)行緩沖液：30 mmol/L Na2B4O7-NaH2PO4（pH 9.8，包含0.5%BC素）緩沖液。

2 結(jié)果與討論

2.1 分離緩沖液種類選擇

分離緩沖液種類對(duì)17種氨基酸分離效果的影響見(jiàn)圖1。

圖1 分離緩沖液種類對(duì)17種氨基酸分離效果的影響Fig.1 Effect of running buffer on separation of 17 amino acids

不同的電泳緩沖液對(duì)分離物的溶解能力不同，進(jìn)而影響遷移時(shí)間和分離度。此外，電泳緩沖液的選擇主要取決于所需的pH。FITC熒光強(qiáng)度對(duì)環(huán)境pH較為敏感，pH低于7時(shí)，其熒光強(qiáng)度會(huì)顯著猝滅，pH 9～10時(shí)，熒光強(qiáng)度基本達(dá)到峰值。本試驗(yàn)考察了磷酸鹽緩沖液、硼酸鹽緩沖液及硼砂-磷酸鹽緩沖液對(duì)氨基酸分離效果的影響。結(jié)果如圖1顯示硼砂-磷酸鹽緩沖液能實(shí)現(xiàn)17種氨基酸的基線分離。因此，選擇硼砂-磷酸鹽緩沖液作為分離電解質(zhì)溶液。

2.2 分離緩沖液pH優(yōu)化

分離緩沖液pH對(duì)17種氨基酸分離效果的影響見(jiàn)圖2。

圖2 分離緩沖液pH對(duì)17種氨基酸分離效果的影響Fig.2 Effect of running buffer pH on separation of 17 amino acids

分離緩沖液pH直接影響分析物解離情況及帶電荷情況，進(jìn)而影響分析物保留情況及分離效果。本試驗(yàn)考察了9.6、9.8、10.0 3個(gè)pH梯度對(duì)氨基酸分離效果的影響。如圖2所示，在此pH條件下絕大多數(shù)氨基酸凈電荷為負(fù)值，與毛細(xì)管內(nèi)壁的硅羥基無(wú)吸附作用。但隨著凈負(fù)電荷的增多，電遷移速度增加，最終導(dǎo)致保留時(shí)間延長(zhǎng)。此外，隨著pH變化，各氨基酸帶電量直接影響了他們的保留情況及分離效果。綜合考慮，選擇9.8作為分離緩沖液最佳pH。

2.3 分離緩沖液離子強(qiáng)度的選擇

分離緩沖液離子強(qiáng)度對(duì)17種氨基酸分離效果的影響見(jiàn)圖3。

圖3 分離緩沖液濃度對(duì)17種氨基酸分離效果的影響Fig.3 Effect of running buffer concentration on separation of 17 amino acids

在毛細(xì)管電泳分離過(guò)程中，分離緩沖液離子強(qiáng)度是影響分析物遷移行為的關(guān)鍵因素之一。隨著分離緩沖液濃度從25 mmol/L增加到35 mmol/L，雙電層厚度減小，導(dǎo)致電滲流減小，分析時(shí)間從22 min延長(zhǎng)至30 min。同時(shí)，分離緩沖液濃度增加還會(huì)使得電流強(qiáng)度及熱效應(yīng)增加，加劇分離物縱向擴(kuò)散，致使峰形展寬。綜合考慮分析時(shí)間和峰形，選擇30 mmol/L作為分離緩沖液最佳濃度。

2.4 分離電壓優(yōu)化

高電壓能夠通過(guò)提高電場(chǎng)強(qiáng)度直接縮短分析時(shí)間，同時(shí)在一定程度上改善峰形。但是電壓過(guò)高同樣使熱效應(yīng)增加，降低柱效和分離度。本試驗(yàn)選擇25 kV作為最佳分離電壓。

2.5 BC添加量?jī)?yōu)化

BC添加量對(duì)17種氨基酸分離效果的影響見(jiàn)圖4。

圖4 BC對(duì)17種氨基酸分離效果的影響Fig.4 Effect of BC on separation of 17 amino acids

BC的添加對(duì)于氨基酸分離效果有明顯的改善作用，如圖4所示，當(dāng)添加量為0.5%時(shí)，17種氨基酸基本達(dá)到基線分離。繼續(xù)增加BC添加量，不但不能改善分離效果，還會(huì)造成電流不穩(wěn)甚至斷電流。因此BC最佳添加量為0.5%。

2.6 分析方法評(píng)價(jià)

以氨基酸濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。各種氨基酸檢測(cè)限、線性范圍、回歸方程及相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表1。

表1 17種氨基酸的線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍及檢出限Table 1 Regression equations，correlation coefficients（r2），linear ranges and limit of detection of 17 amino acids

2.7 精密度

17種氨基酸保留時(shí)間及峰面積精密度計(jì)算結(jié)果如表2所示。

表2 17種氨基酸日間、日內(nèi)測(cè)定精密度Table 2 Intra-day and inter-day precision of 17 amino acids

同一日內(nèi)，對(duì)氨基酸衍生液（5×10-8mol/L）連續(xù)測(cè)定11次，計(jì)算各氨基酸峰面積、保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（Relative standard deviation，RSDs）得到日內(nèi)精密度。每日配置新鮮試劑對(duì)氨基酸衍生，連續(xù)5天進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算各氨基酸峰面積、保留時(shí)間的RSDs，得日間精密度。

2.8 加標(biāo)回收試驗(yàn)及實(shí)際樣品測(cè)定

洋槐蜜中17種氨基酸的加標(biāo)回收率如表3所示。

表3 洋槐蜜中17種氨基酸的加標(biāo)回收率（X±SD，n=3）Table 3 Recoveries of 17 amino acids spiked in honey（mean±SD，n=3）

續(xù)表3 洋槐蜜中17種氨基酸的加標(biāo)回收率（X±SD，n=3）Continut table 3 Recoveries of 17 amino acids spiked in honey（mean±SD，n=3）

續(xù)表3 洋槐蜜中17種氨基酸的加標(biāo)回收率（X±SD，n=3）Continut table 3 Recoveries of 17 amino acids spiked in honey（mean±SD，n=3）

向已知分析物含量的洋槐蜜樣品中分別加入100.00、200.00、500.00 mg/kg 3個(gè)不同的濃度水平的氨基酸標(biāo)品，提取后通過(guò)該方法測(cè)定回收率。結(jié)果顯示，回收率均在81.10%以上，RSD小于8.22%。

將該方法用于洋槐蜂蜜、棗花蜂蜜及蜂王漿3種蜂制品中氨基酸組成分析。圖5為3種蜂制品典型的氨基酸特征圖譜，各氨基酸含量列于表4。

圖5 3種蜂產(chǎn)品中氨基酸指紋圖譜Fig.5 Fingerprints of amino acids in three bee products

由于蜜源不同，各蜂制品中氨基酸含量及組成差異較大。蜂王漿中含有17種氨基酸，總含量達(dá)2 987.61 mg/kg。洋槐蜂蜜中不含精氨酸和蛋氨酸，棗花蜂蜜中不含酪氨酸、蛋氨酸和胱氨酸，氨基酸總量分別為1 147.89 mg/kg和1 389.22 mg/kg。亮氨酸、脯氨酸、絲氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸在3種蜂制品中含量均相對(duì)較高。其中棗花蜜中苯丙氨酸含量最高為336.33 mg/kg，蜂王漿蜜膏中天冬氨酸含量最高為561.13 mg/kg。

表4 3種蜂產(chǎn)品中氨基酸組成Table 4 Contents of amino acids in three bee products

3 結(jié)論

本研究以BC為電泳緩沖液添加劑，提高毛細(xì)管電泳分離能力，構(gòu)建基于蜂蜜中氨基酸組成的指紋圖譜分析方法。優(yōu)化條件下，該方法能在25 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)17種氨基酸的基線分離，方法檢測(cè)限2.5×10-4μmol/L～30.0×10-4μmol/L。洋槐蜂蜜的加標(biāo)回收率在81.10%以上，RSDs小于8.22%，證明所構(gòu)建的方法是可靠的。該方法成功用于洋槐蜜、棗花蜜及蜂王漿蜜膏中氨基酸組成分析。結(jié)果表明，不同植物蜜源蜂蜜中氨基酸種類、含量存在明顯差異。該方法為天然蜂蜜質(zhì)量控制提供新參考。

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