發酵雞血中菌種擴大培養條件的優化

梁肖娜，孔彥文，陶冬冰，孔繁華，韓宏嬌，吳尚，吳尚儀，岳喜慶

（沈陽農業大學食品學院，遼寧沈陽110866）

近年來，隨著人們生活水平的迅速的提高，我國畜禽業的發展也伴隨著突飛猛進，畜禽的數量也不斷增加，因此動物血液的數量也隨之增加[1]。隨著畜禽工業的發展，雞血的產量也迅速增加，但是目前我國對雞血的使用基本上沒有被開發和利用，相反而是直接被排放到畜禽屠宰場周圍的環境中，對環境的影響造成極其惡劣的影響[2]。除此之外，雞血的大量流失不僅造成了環境的嚴重污染，而且也使得蛋白質原料的大量的浪費。據調查研究顯示，畜禽類的動物血液，尤其雞血是一種含有極其豐富的蛋白質，大量的糖類、脂類、和氨類化學物質，含有生命體所需要的大部分的氨基酸、礦物質（鉀、鈉、鎂、磷、鐵）等物質以無機鹽的形式存在[3]。因此，對于雞血的再次開發和利用，將會為我國創造更多和更加可觀的經濟和社會效益。

本試驗從環境和經濟效益出發，利用微生物培養和發酵技術，篩選出適合雞血發酵的優勢菌株，對優勢菌株的發酵和生長配方進行篩選，研究出適合菌株發酵雞血的最佳的生長條件，可以將雞血中大分子的蛋白質等大分子物質分解成為更加適合，或者被動物、植物直接吸收和利用的可溶性的小分子蛋白質等物質，從而為雞血等其他類的動物血液的而進一步的研究與開發利用提供堅實的理論和試驗依據[4]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮雞血：由沈陽市偉峰肉雞加工廠提供；供式菌株，4種菌株（A7蘇云金芽孢桿菌Bacillus thuringiensis、A8 希瓦氏菌 Shewanella sp.、B1 青霉菌屬Penicillium citreonigrum、B4塔賓曲霉Aspergillus tubingensi）：由沈陽農業大學實驗室分離篩選提供；液體培養基：由沈陽農業大學實驗室配制而成；牛肉膏、蛋白胨、瓊脂、氯化鈉、牛肉浸粉、酵母浸粉、七水硫酸鎂、硝酸鈉、磷酸氫二鉀、硫酸亞鐵、硫酸銨、甲醛、乙酰丙酮、乙酸：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

HZQ-C型恒溫震蕩培養箱：哈爾濱東聯電子公司；TG16-WS臺式高速離心機：長沙湘儀離心機儀器有限公司；UV-1600紫外/可見分光光度計：北京瑞利分析儀器公司；ACCULAB VICON電子精密天平：北京賽多利斯儀器系統有限公司；ZDX-35BI型座式自動電熱壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫療器械廠；尼康生物顯微鏡：南京江南光電（集團）股份有限公司；DW-86L486超低溫冰箱：德國Eppendorf公司；BCM-1000A生物潔凈工作臺：蘇州市華宇凈化設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 優勢菌種生長曲線的測定

1.3.1.1 光電比濁計數法[5]

將1.1中得到的細菌優勢菌株在細菌培養基上進行活化，將活化好的菌株分別接種到50 mL的細菌液體培養基中，160 r/min、37℃搖床培養，每隔2 h測定各菌株在600 nm處的吸光值，以培養時間為橫坐標，OD600值為縱坐標，繪制各優勢菌株的生長曲線，從而確定細菌制備種子液的最佳時間。

1.3.1.2 稱干重法[6-7]

將1.1中得到的霉菌優勢菌株在霉菌斜面培養基上進行活化，向活化后的菌種斜面中加入5 mL生理鹽水，用接種環刮下菌苔制成菌懸液。將此菌懸液再稀釋10倍后，在300 mL三角瓶中分別裝30 mL液體繁殖培養基，接種500 μL孢子懸浮液，30℃搖瓶培養，每隔24小時取出三角瓶，將培養液抽濾于定量濾紙上，用蒸餾水洗滌2次～3次，100℃～105℃烘至恒重，稱量菌體干重。以時間為橫坐標，干重為縱坐標，繪制生長曲線從而確定霉菌制備種子液的最佳時間。

1.3.2 優勢菌株種子液的制備[8]

首先用細菌和霉菌平板培養基分別對篩選分離得到的細菌和霉菌優勢菌株在適宜的溫度條件下進行活化培養，然后將活化好的細菌和霉菌優勢菌株分別接入到裝有50 mL相應液體培養基的錐形瓶中，其中細菌在37℃，160 r/min，霉菌在30℃，160 r/min的條件下恒溫振蕩培養至對數期取出，然后在4℃條件下，11 000 r/min，離心15 min，棄去上清液，加無菌生理鹽水進行重懸，反復吹打液體，重復3次以上操作，最后將菌種濃度調至108個cfu/mL的數量級，4℃下保存備用。

1.3.3 游離氨基酸態氮含量的測定[9]

1.3.3.1 游離氨基酸態氮標準曲線的繪制

稱取硫酸銨0.472 0 g于100 mL容量瓶中，加蒸餾水溶解并定容至100 mL，充分振蕩混勻后放置4℃冰箱中備用，該溶液含氮量為1.0 mg/mL。使用時用移液槍吸取10 mL該溶液并定容至100 mL容量瓶，則該溶液含氮量為100 mg/mL。標準曲線的測定用移液槍分別準確吸取 0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mL的100 μg/mL硫酸銨標準溶液分別放置于10 mL具塞比色管中，分別加4 mL乙酸銨緩沖溶液和4 mL顯色劑，加蒸餾水定容至10 mL，混勻后劇烈震蕩1 min，放入到100℃水浴鍋中加熱15 min，取出后冷卻至室溫。零管作為空白對照，將樣品在400nm波長下測量吸光值，根據各濃度下的吸光度值繪制標準曲線。

1.3.3.2 雞血發酵液中游離氨基酸態氮含量的測定

吸取待測樣品1 mL定容到1 000 mL容量瓶中，充分震蕩混勻備用，用移液槍吸取1 mL樣品稀釋液放入到10 mL具塞比色管中，分別加4 mL乙酸銨緩沖溶液和4 mL顯色劑，加蒸餾水定容至10 mL，混勻后劇烈震蕩1 min，放入到100℃水浴鍋中加熱15 min，取出后冷卻至室溫。將樣品在400 nm波長下測量吸光值。

1.3.4 單株菌株發酵雞血的效果測定[10]

用移液槍準確吸取2.5 mL新鮮雞血于250 mL錐形瓶中，準確加入22.5 mL蒸餾水于上述錐形瓶中，瓶口用封口膜密封，在121℃下滅菌20 min，于無菌條件下分別將4株優勢菌株種子液準確加入到錐形瓶中，種子液的添加量按照5%的比例加入到已經滅菌的新鮮雞血中，在其自然pH值的條件下，混勻放入到恒溫培養箱中，調節恒溫培養箱培養條件為160 r/min、28℃，恒溫發酵5天后取出，測定發酵雞血中游離氨基酸態氮含量，每組至少3個平行。

1.3.5 混合菌株發酵雞血的效果測定

用移液槍準確吸取2.5 mL新鮮雞血于250 mL錐形瓶中，準確加入22.5 mL蒸餾水于上述錐形瓶中，瓶口用封口膜密封，在121℃下滅菌20 min，于無菌條件下將4株優勢菌株種子液準確加入到錐形瓶中，種子液的添加量按照1∶1∶1∶1的體積比例加入到已經滅菌的新鮮雞血中，在其自然pH值的條件下，混勻放入到恒溫培養箱中，調節恒溫培養箱培養條件為160 r/min、28℃，恒溫發酵5天后取出，測定發酵雞血中游離氨基酸態氮含量，每組至少3個平行。

1.3.6 混合菌株擴大培養的單因素試驗

1.3.6.1 溫度對混合菌株擴大培養條件的影響

準確配制自制液體培養基，裝入250 mL錐形瓶中，瓶口用封口膜密封，在121℃下滅菌20 min，于無菌條件下將4株優勢菌株種子液準確加入到錐形瓶中，種子液的添加量按照1∶1∶1∶1的體積比例加入，調節 pH=7，分別放在 28、30、32、34、36 ℃的中，同時調節轉速為160 r/min，恒溫培養12 h，等待菌液靜置后，取適量上清液，分別測定5分菌液培養基的OD600吸光度值。

1.3.6.2 pH值對混合菌株擴大培養條件的影響

準確配制自制液體培養基，裝入250 mL錐形瓶中，瓶口用封口膜密封，在121℃下滅菌20 min，于無菌條件下將4株優勢菌株種子液準確加入到錐形瓶中，種子液的添加量按照1∶1∶1∶1的體積比例加入，分別調至pH值為4、5、6、7、8，將恒溫培養箱調節在30℃、160 r/min的條件下培養12 h，等待菌液靜置后，取適量上清液，分別測定5分菌液培養基的OD600吸光度值。

1.3.6.3 轉速對混合菌株擴大培養條件的影響

準確配制自制液體培養基，裝入250 mL錐形瓶中，瓶口用封口膜密封，在121℃下滅菌20 min，于無菌條件下將4株優勢菌株種子液準確加入到錐形瓶中，種子液的添加量按照1∶1∶1∶1的體積比例加入，調節 pH=7，分別調至搖床轉速為 100、120、140、160、180、200 r/min，將恒溫培養箱調節在30℃的條件下培養12 h，等待菌液靜置后，取適量上清液，分別測定5分菌液培養基的OD600吸光度值。

1.3.7 混合菌株擴大培養工藝條件的優化設計

試驗選擇溫度、pH值、轉速3個因素條件對混合菌株擴大培養條件進行響應面試驗設計，通過Design Expert8.0.6軟件對試驗數據進行回歸性分析和比較來預測混合菌株擴大培養的最優的工藝參數。響應面分析因素及水平見表1。

表1 響應面分析因素及水平Table 1 Factors and levels of response surface design analysis

1.3.8 試驗驗證

根據響應面得到的混合菌株擴大培養條件的工藝條件后，按照最佳工藝條件進行3次重復試驗，最終驗證響應面的試驗參數是否準確可靠。

1.3.9 數據統計分析

以上試驗數據均進行3次平行測定，試驗結果以平均值±標準偏差表示，采用Excel、Design-expert8.0.6軟件對試驗數據進行分析。

2 結果與分析

2.1 菌株生長曲線的測定

細菌和霉菌的生長周期為延滯期、對數期、穩定期以及衰亡期4個特征時期。菌株生長曲線的測定見圖 1、圖 2。

圖1 兩株細菌的生長曲線Fig.1 Growth curve of two bacteria strains

如圖1所示，細菌A7蘇云金芽孢桿菌Bacillus thuringiensis和A8希瓦氏菌Shewanella sp.的OD值在0～4 h時處于穩定狀態；但是在4 h～12 h時，菌液的OD值迅速增大，此時表明在4 h～12 h時，菌株的生長正在處于對數生長期；12 h后菌液的OD值進入穩定狀態并且逐漸趨于平穩，表明此時菌株進入穩定期；隨著時間的增長大約在16 h后菌液的OD值逐漸降低，表明菌株逐漸進入到衰亡期。綜上所述，種子液的制備時間制定在4 h～12 h之間內進行種子液的制備。從圖2中可以看出，霉菌B1青霉菌屬Penicillium citreonigrum、B4塔賓曲霉Aspergillus tubingensi的OD值在菌液培養的0～2 d時幾乎處于穩定狀態，變化不大；2 d～7 d時霉菌的菌液OD值迅速增大，可以得出此時的霉菌菌株在處于對數生長期；到菌株生長的7 d～9 d時菌液的OD值趨于穩定狀態，變化微小；9 d～10 d時，菌液OD值迅速降低，此時處于衰亡期。因此，最終將種子液的最佳制備時間最終確定在2 d～7 d內。

圖2 兩株霉菌的生長曲線Fig.2 Growth curve of two yeast strains

2.2 游離氨基酸態氮標準曲線

游離氨基酸態氮標準曲線見圖3。

圖3 游離氨基酸態氮標準曲線Fig.3 Standard curve of free amino acid nitrogen

如圖3所示，試驗以硫酸銨濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標建立標準曲線，回歸方程y=0.007 3x+0.006 2，相關系數R2=0.998 5，游離氨基酸態氮含量在0～100 μg/mL范圍內與吸光度線性關系良好。

2.3 單株菌株發酵雞血的效果測定

單株菌株發酵雞血的效果見圖4。

如圖4所示，與空白對照組相比較，各株優勢菌株對發酵雞血中游離氨基酸態氮的影響效果均在不同程度上大于空白對照組，其中優勢菌株A7和A8對雞血中游離氨基酸態氮的影響效果與空白對照組相比，在數據統計學上均有極顯著性差異（P≤0.01），A7和A8發酵雞血中產生的游離氨基酸態氮的含量分別為30.2、30.7 μg/mL，約是空白對照組中游離氨基酸態氮的含量的2倍左右。B1和B4對雞血中游離氨基酸態氮的影響效果與空白對照組相比，差異不顯著（P＞0.5）。由此可以說明，各株優勢菌株對于發酵雞血的影響效果均有影響，每株優勢菌株都可以利用發酵雞血，在一定程度上提高雞血中游離氨基酸態氮的含量，這有可能是由于每種菌株對于發酵雞血的能力各有差異所造成的，與各菌株在雞血發酵過程中產生的酶類有一定的相關性。

圖4 單株菌株發酵雞血的效果Fig.4 The effect of single strain ferment chicken blood

2.4 混合菌株發酵雞血的效果測定

混合菌株發酵雞血的效果如圖5所示。

圖5 混合菌株發酵雞血的效果Fig.5 The effect of mixed ferment chicken blood

從圖5中可以看出，菌株混合后發酵雞血中游離氨基酸態氮的含量與空白對照組相比均有明顯上升，各混合組菌株對游離氨基酸態氮含量的影響效果差異極其顯著（P≤0.01），其中混合菌株 A7、A8、B1和B4組中游離氨基酸態氮含量約為41.7 μg/mL，約是空白對照組中游離氨基酸態氮含量的2.5倍左右。與此同時，與2.3中單株菌株發酵雞血的效果相比較，游離氨基酸態氮含量遠遠高于單株菌株發酵雞血中的含量。因此可以說明，混合菌株的共同發酵的效果最好，確定混合菌株A7、A8、B1和B4組為發酵雞血的最佳菌株組合。

2.5 溫度對混合菌株擴大培養條件的影響

溫度對菌株擴大培養條件的影響結果如圖6所示。

由圖6可知，隨著培養溫度的升高，菌液OD600值也逐漸升高，當菌液培養溫度達到30℃時，菌液OD600值達到最大，但是隨著溫度降低，菌液OD600值也開始緩慢下降。這可能是由于混合菌株在溫度為30℃時，各菌株的生長代謝最為旺盛，隨著溫度的逐漸升高，會阻礙各菌株的正常生長和繁殖。因此最終確定混合菌株擴大培養的最佳溫度為30℃。

圖6 溫度對混合菌株擴大培養條件的影響Fig.6 Effect of temperature on expanded culture conditions of mixed strains

2.6 pH值對混合菌株擴大培養條件的影響

pH值對菌株擴大培養條件的影響結果如圖7所示。

圖7 pH值對混合菌株擴大培養條件的影響Fig.7 Effect of pH on expanded culture conditions of mixed strains

菌株只有在最適合培養液的pH值下，才可以促進微生物菌株的生長代謝和繁殖，否則會抑制微生物的生命活動。如圖7所示，調節菌液的pH值從4到6時，菌液OD600值迅速上升，當pH值為7時，OD600值達到高峰，之后逐漸迅速降低。由此可以說明，當菌液pH值為7時，最適合各菌株的生長，因此最終確定pH值為7是混合菌株擴大培養的最佳pH值。

2.7 轉速對混合菌株擴大培養條件的影響

轉速對混合菌株擴大培養條件的影響結果如圖8所示。

圖8 轉速對混合菌株擴大培養條件的影響Fig.8 Effect of speed on expanded culture conditions of mixed strains

由圖8可知，隨著搖床轉速的逐漸提高，菌液OD600值緩慢上升，當轉速增加到140 r/min時，OD600值停止增加，并且隨著轉速的增加，值開始迅速下降。對微生物菌液的進行攪拌，可以使菌液的流體速度增大，因此溶解氧的速度伴隨增加，這時候對于微生物生長和其產物的轉化有一定的促進效果。但是轉速的改變可以直接影響到氧氣的傳遞，因此最終確定搖床轉速為140 r/min為混合菌株發酵的最佳轉速條件。

2.8 混合菌株擴大培養工藝條件的優化設計

2.8.1 響應面試驗設計結果及方差分析

響應面試驗設計結果及方差分析如表2和表3所示。

表2 響應面試驗設計及結果Table 2 Design and results of response surface analysis test

表3 方差分析表Table 3 Variance analysis of regression equation

依據表2中試驗結果，利用Design Expert 8.0.6軟件進行二次多元回歸擬合，得到如下多元回歸方程：Y=-621.143 20+24.123 63A+35.138 80B+1.994 00C-0.466 25AB-4.625 00×10-3AB-6.250 00×10-4BC-0.337 30A2-1.501 70B2-6.460 50×10-3C2

圖9 溫度和pH值對OD值的等高線（右）和響應曲面圖（左）Fig.9 Temperature and pH on OD contour（right）and response surface map（left）

由表3可知，此模型的P＜0.000 1，說明OD值與所考察的自變量之間的線性關系極顯著，模型的確定系數R2=0.998 9，修正后的確定系數R2Adj=0.997 8，說明該模型可以解釋99.78%的變化，擬合程度良好；其中失擬項P＞0.05，影響不顯著，說明所選的模型適合，可以用該模型來進行擬合試驗，一次項C和二次項A2、B2、C2極顯著，可以說明對響應值的影響極顯著；對OD600的影響順序依次為pH值＞溫度＞轉速，即pH值對于OD600的影響較為顯著。

2.8.2 響應面各因素間的交互作用分析與優化

利用Design Expert 8.0.6軟件對表2中的數據進行回歸方程的的擬合，得到圖9～圖11的等高線和響應面圖。

圖10 溫度和轉速對OD值的等高線（右）和響應曲面圖（左）Fig.10 Temperature and speed on OD contour（right）and response surface map（left）

圖11 轉速和pH值對OD值的等高線（右）和響應曲面圖（左）Fig.11 Speed and pH on OD contour（right）and response surface map（left）

從圖9種可以看出溫度和pH值交互作用對OD值的影響，響應面圖可以清楚的看到溫度和pH值間形成響應面的曲面變化幅度都較為明顯，說明溫度和pH值對OD值的影響非常顯著。從左側的等高線圖中可以看出，響應面的最高點也是等高線圖中的最小圖形的中心點，溫度和pH值所形成的等高線圖形接近橢圓形，說明兩者間的交互作用極其明顯，這與二次多元回歸方程擬合的方差分析結果是相互一致的。圖10結果表明，溫度和轉速對OD值的影響作用，可以看出，當培養溫度一定時，OD值隨著轉速的升高而增加，但是當轉速增加到140 r/min中時，OD值又開始逐漸的降低，除此之外可以看到，轉速的曲面變化幅度大于溫度，說明轉速對OD值的影響較為顯著，另外從等高線圖可以看出，溫度和轉速交互作用顯著。轉速和pH值對OD值的影響作用見圖11。從圖中可知，pH值的曲面變化幅度較小，而轉速的變化幅度較大，由此可以說明，轉速對OD值的影響作用大于pH值，同時也說明轉速對OD值的影響極顯著，這與二次多元回歸方程擬合的方差分析結果是一致的。

2.8.3 驗證性試驗

利用Design Expert 8.0.6軟件求解回歸方程可以得到，混合菌株擴大培養的最佳的工藝條件為：溫度30℃、pH=7、轉速140 r/min，在此最佳的條件下得到的OD值的理論值可以達到8.74。為檢驗方程的可靠性，在此優化的條件下進行3次重復性試驗驗證，最終得到3次試驗的OD值分別為8.66、8.78和8.85，平均值為8.76，這與該理論值較為接近，由此可以說明該響應面對混合菌株擴大培養的最佳的工藝條件具有實際可操作性。

3 結論

本試驗以雞血作為發酵原料，研究優勢復合菌種擴大培養條件，根據中心組合Box Behnken（BBD）的設計原理和響應面的分析方法，并利用利用Design Expert 8.0.6軟件進行試驗設計和統計分析，得到OD值與溫度、pH值、轉速的回歸模型，并對方程進行求解得到最佳的混合菌株的發酵條件為：溫度30℃、pH=7、轉速140 r/min，在此條件下OD值的理論值為8.74，在此條件下經過驗證性試驗得到，菌液的平均OD值約為8.76，由此可以說明該試驗模型是可靠合理，具有一定的實際的指導價值和意義。本試驗從生產實際出發，研究雞血等動物性食品綜合性開發，為新產品的開發和利用提供新的思路和想法。

[1]高薇薇,鄧海燕,謝苗,等.雞血的利用現狀與展望[J].肉類工業,2004(2):42-46

[2]譚小林.動物血液利用的新途徑[J].肉類工業,1989(2):42

[3]程池,蔡永峰.可食用動物血液資源的開發利用[J].食品與發酵工業,1998(3):68-74

[4]曾利平,周紅,李俊田,等.雞血酶解工藝條件的研究[J].食品與發酵技,2010,46(2):77-80

[5]朱艷蕾.細菌生長曲線測定實驗方法的研究[J].微生物學雜志,2016,36(5):108-112

[6]吳巨賢.蛋卷中霉菌生長模型研究[J].輕工科技,2013,29(8):16-17,19

[7]王宇雯.對霉菌試驗中關于試驗周期的研究[J].環境技術,1995(2):12-15

[8]楊國良.發酵罐培養中種子液最佳培養時間的確定[C].中國畜牧獸醫學會生物制品學分會中國微生物學會獸醫微生物學專業委員會2010年學術年會(第三屆中國獸藥大會學術論壇)論文集,2010:5

[9]王文秀,于佳,李釤,等.不同條件對納豆菌發酵蛤蜊產物中游離氨基酸態氮含量及納豆激酶活性的影響[J].食品科學,2015,36(9):113-116

[10]宋敏.微生物肥料的菌種篩選及發酵工藝研究[D].舟山:浙江海洋學院,2015

[11]秦鵬,王龍,趙玉卉,等.響應面法優化蛹蟲草菌絲液體發酵產蟲草素培養基[J].食品工業科技,2016,37(8):185-190

[12]陳畑,彭婷婷,王堯,等.響應面法優化從絲狀真菌中制取殼聚糖的研究[J].廣州化工,2014,42(20):80-82

[13]竹文坤,牟濤,段濤,等.響應面法優化微生物誘導碳酸鈣沉積培養基[J].化工進展,2014,33(6):1533-1538

[14]PARAMITHIOTIS E,RATCLIFFE M J.Bursa-dependent subpopulations of peripheral B lymphocytes in chicken blood[J].European Journal of Immunology,1993,23:96-102

[15]COURI D,ABDELRAHMAN M S.Effect of chlorine dioxide and metabolites on glutathione dependent system in rat,mouse and chicken blood[J].J Environ Pathol Toxicol,1979,3:451-460

[16]BISHOP C.Purine Metabolism in Human and Chicken Blood,in Vitro[J].Journal of Biological Chemistry,1960,235:3228-3232

[17]LI Q,FU C.Application of response surface methodology for extractionoptimizationof germinant pumpkin seeds protein[J].Food Chemistry,2005,92:701-706

[18]SANT'ANNA M R V,ALEXANDR N,BRUCE A,et al.Chicken blood provides a suitable meal for the sand flyLutzomyia longipalpisand does not inhibitLeishmaniadevelopment in the gut[J].Parasites&Vectors,2010,3(1):1-11

[19]高樹云,劉兆仁,趙三強,等.雞血中抗菌肽的提取、純化和抑菌效果檢測[J].農業工程技術(農產品加工業),2012(6):32-34

[20]張恒,王新華,龔飛琴.雞血中血紅素的提取[J].中國家禽,1998(4):10-11