3種動物源性成分陽性標準分子的構建與應用

鄭世超，郭穎慧，董海龍，翟清燕，霍勝楠，*

（1.山東省食品藥品檢驗研究院，山東濟南250101；2.山東省產品質量監督檢驗研究院，山東濟南250100）

2013年，內蒙古某食品企業使用鴨肉為原材料生產假劣牛肉干、羊肉干，案值超過600萬元。同年，食品安全體系完善的歐洲也曝出馬肉冒充牛肉事件[1]。2014年山東一家沃爾瑪超市又曝出使用狐貍肉冒充“五香驢肉”事件。近些年來，肉類摻假問題層出不窮，個別食品生產經營者為了牟取暴利，采取不法手段以次充好，以劣充優，以假亂真，對食品進行摻偽（摻假、摻雜、偽造的總稱）。摻加的其他肉源，不但營養堪憂，甚至沒有經過檢疫或是病死畜禽肉，給百姓健康帶來了極為嚴重的影響。

熒光定量聚合酶鏈式反應（real-time Fluorescent Quantitative Polymerase Chain Reaction，FQ-PCR）方法是聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）技術的一種，是目前公認的核酸檢測最常用檢測方法之一[2]。實時熒光定量PCR技術在PCR反應體系中加入能特異標記PCR產物的熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，最后通過標準曲線對樣品進行定量分析，實現了PCR技術由定性到定量的飛躍[3]。

使用FQ-PCR技術對樣品進行檢測時需要陽性參考物質作為對照，以保證試驗結果的可靠性。因此，陽性參考物質的質量與實驗結果的準確性密切相關。現階段，對于動物源性成分的檢測過程中所用的陽性參考物質通常是動物基因組DNA[4]。提取動物源性成分基因組DNA過程復雜，制備不便、不能滿足長期貯存，有證標準物質生產工藝復雜、價格昂貴等問題，已成為檢測方法建立和應用的瓶頸[5]。

為了解決這個難題，眾多檢測機構都在研究用陽性標準分子替代基體標準物質。如何利用已知序列的動物源性成分研發出容易獲取的、可大量生產的陽性參考物質，以滿足肉及肉制品食品安全監管工作的需求至關重要，動物源性成分檢測陽性標準分子是滿足當前檢測用需要的最優選擇[6]。陽性標準分子具有以下優點：1）可根據檢測需要設計引物和探針，同一個標準分子可以同時包含多個外源目的基因，可使用多重PCR反應體系，一次性檢測多種成分；2）省去了傳統陽性參考物質制備中煩瑣的動物基因組提取和鑒定步驟；3）在實時熒光定量PCR檢測過程中，陽性標準分子根據分子量大小與動物基因組DNA分子換算，可以完成樣品中某種動物源性成分的定量分析；4）質粒DNA純度高，避免了動物基因組制備時蛋白質、RNA等雜質的干擾；5）可以通過微生物進行大量培養，易保存，不易發生變異。

《中華人民共和國食品安全法》第二十八條明確規定：禁止生產經營摻假摻雜食品。不法分子為了牟取暴利，以次充好，擾亂了肉制品生產，損害了消費者正當權益。然而，現有食品及相關產品中動物源性成分檢測標準還不夠健全，開發特異性強，靈敏度高的檢測方法尤為重要。本研究根據豬、牛、鴨線粒體基因保守序列設計引物、TaqMan探針，并構建豬、牛、鴨成分特異性檢測用陽性標準分子，驗證了方法的特異性、靈敏度與穩定性，建立了豬、牛、鴨源性成分的定性、定量檢測方法，并對市售食品樣本進行了豬、牛、鴨源性成分的檢測，為肉及肉制品的食品安全監管提供了陽性材料和檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

豬肉、牛肉、鴨肉為生鮮肉，均購于當地超市。

1.2 試劑

限制性內切酶Pst I、Sal I以及限制性內切酶緩沖液、pMD18-T載體、T4 DNA連接酶及其緩沖液、dNTPs、Taq DNA 聚合酶及其緩沖液、DL 2000Marker、Agarose Gel DNA Purification Kit、DNA提取試劑盒、大腸桿菌DH5α感受態細胞：大連寶生物工程有限公司；TaqMan探針及引物：上海博尚生物技術有限公司合成。

1.3 儀器

7500 FAST實時熒光PCR儀：美國ABI公司；NanoDrop 2000c紫外可見分光光度計、ST40臺式離心機：美國賽默飛世爾公司；comfort恒溫混勻器：德國艾本德公司；SPL-250培養箱：天津萊玻特瑞公司；MS204S電子天平：梅特勒公司等。

1.4 總DNA提取

采用DNeasy Blood&Tissue Kit提取豬、牛、鴨3種生鮮肉樣品的基因組DNA，用分光光度計檢測DNA純度和濃度。

1.5 PCR反應條件

在GenBank中搜索18SrRNA基因序列和豬、牛、鴨的線粒體基因序列，根據獲得的18SrRNA基因序列和線粒體基因序列，利用Primer 5.0設計兩對PCR引物，分別用于擴增18SrRNA基因序列和線粒體基因序列[7]。以豬、牛、鴨肉基因組為模板，用所設計的引物組合，進行PCR擴增。PCR的25 μL反應體系為起始引物（10 μmol/L）1 μL，終止引物（10 μmol/L）1 μL，引物序列見表1，模板基因組DNA 3 μL，rTaq酶預混液12.5 μL，加ddH2O調整反應總體系體積為25 μL。反應條件為94℃變性 5 min；94℃變性 30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，共進行40次循環。

1.6 構建陽性標準分子

根據設計的PCR引物，采用引物對豬、牛、鴨的基因組DNA進行擴增，擴增得到序列。PCR產物通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離，目的產物用膠回收試劑盒純化。將PCR純化產物與pMD18-T載體進行連接，4℃過夜連接。重組子命名為18S-pMD18-T及豬質粒PCOXI-pMD18-T，牛質粒 BCOXI-pMD18-T，鴨質粒ANAS-pMD18-T。

將18S-pMD18-T及3種動物源性質粒均用Sal I和Pst I進行雙酶切。37℃水浴2 h，瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收，將回收片段連接。4℃過夜連接。搖床均勻混勻2 h進行質粒轉化。將轉化質粒進行凝膠電泳分離，回收大分子質粒條帶進行重組克隆質粒篩選回收。篩選得到重組克隆通過常規PCR驗證及Sal I和Pst I的酶切驗證及質粒測序，最終的重組子陽性質粒標準分子命名為豬陽性標準分子18S-PCOXI-pMD18-T，牛陽性標準分子18S-BCOXI-pMD18-T，鴨陽性標準分子18S-ANAS-pMD18-T。

1.7 實時熒光PCR檢測

豬、牛、鴨成分檢測實時熒光PCR法反應體系：

體積為 25 μL，樣品 DNA（10 μg/mL～100 μg/mL）2 μL，引物各（10 μmol/L）0.5 μL，探針（10 μmol/L）0.5 μL，Taq DNA 聚合酶（5 U/μL）0.3 μL，dNTP（各2.5 mmol/L）2 μL，10×PCR 緩沖液 2.5 μL，水 16.7 μL。PCR反應條件為：95℃預變性10 s；95℃變性5 s，60℃退火40 s，60℃收集熒光，40個循環。用于檢測18Sr-RNA基因序列和3種動物源性成分線粒體基因序列的引物見表1。

2 結果與分析

2.1 陽性標準分子構建結果

首先利用引物擴增檢測內參18SrRNA基因序列和線粒體基因序列。得到擴增序列，結果見圖1～圖3，進行測序并與GenBank數據庫中的序列進行比對，選擇無錯配堿基的克隆用于下一步試驗。

圖1 豬18SrRNA和豬線粒體COXI基因PCR擴增瓊脂糖凝膠電泳結果圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis results of pig 18SrRNA and pig mitochondrial COXI gene amplified by PCR

圖2 牛18SrRNA和牛線粒體COXI基因PCR擴增瓊脂糖凝膠電泳結果圖Fig.2 Agarose gel electrophoresis results of bovine 18SrRNA and bovine mitochondrial COXI gene amplified by PCR

圖3 鴨18SrRNA和鴨線粒體基因PCR擴增瓊脂糖凝膠電泳結果圖Fig.3 Agarose gel electrophoresis results of duck 18SrRNA and duck mitochondrial DNA gene amplified by PCR

將擴增得到的18SrRNA基因序列和線粒體基因序列通過Sal I和Pst I酶造成的特殊酶切位點連接到質粒載體pMD18-T上，從而獲得豬、牛、鴨標準質粒分子（見圖4～圖6）。以質粒分子為模板，分別用引物對其進行PCR擴增，并測序驗證后發現擴增序列與預期大小的片段一致。結果表明構建的豬、牛、鴨源性陽性標準分子包含18SrRNA內標基因以及線粒體特異基因。

圖4 豬陽性標準分子18S-PCOXI-pMD18-T（約3.1kb）的載體結構圖譜Fig.4 Vector structure of pig positive standard molecule 18SPCOXI-pMD18-T（about 3.1 kb）

圖5 牛陽性標準分子18S-PCOXI-pMD18-T的載體（約3.1kb）結構圖譜Fig.5 Vector structure of bovine positive standard molecule 18SPCOXI-pMD18-T（about 3.1 kb）

圖6 鴨陽性標準分子18S-PCOXI-pMD18-T的載體（約2.9kb）結構圖譜Fig.6 Vector structure of duck positive standard molecule 18SANAS-pMD18-T（about 2.9 kb）

表2 用于檢測18SrRNA基因序列和3種動物源性成分線粒體基因序列的引物和探針Table 2 Primers and probes for detecting 18SrRNA gene sequences and mitochondrial sequences of three animal derived components

2.2 特異性測試結果

由實時熒光擴增曲線結果可以看出，針對18Sr-RNA和線粒體基因所設計的特異性檢測用引物和探針（表2），不論對豬、牛、鴨基因組還是本發明的陽性質粒標準分子都能檢測出陽性信號。

圖7 豬陽性標準分子18SrRNA基因序列實時熒光PCR擴增曲線對比圖Fig.7 Comparison of real-time fluorescent PCR amplification curves of pig positive standard molecular 18SrRNA gene sequences

圖8 豬陽性標準分子線粒體基因序列實時熒光PCR擴增曲線對比圖Fig.8 Comparison of real-time fluorescent PCR amplification curves of pig positive standard molecular mitochondrial gene sequences

圖9 牛陽性標準分子18SrRNA基因序列實時熒光PCR擴增曲線對比圖Fig.9 Comparison of real-time fluorescent PCR amplification curves of bovine positive standard molecular 18SrRNA gene sequences

圖10 牛陽性標準分子線粒體基因序列實時熒光PCR擴增曲線對比圖Fig.10 Comparison of real-time fluorescent PCR amplification curves of bovine positive standard molecular mitochondrial gene sequences

圖12 鴨陽性標準分子線粒體基因序列實時熒光PCR擴增曲線對比圖Fig.12 Comparison of real-time fluorescent PCR amplification curves of duck positive standard molecular mitochondrial gene sequences

以表2中的引物和探針對豬、牛、鴨基因組、陰性樣本和陽性標準分子進行實時熒光PCR擴增，陰性樣本為30個常見動植物物種基因組，擴增曲線結果如圖7～圖12所示。結合圖7～圖12可以看出，針對3種動物18SrRNA和線粒體基因序列所設計的引物和探針，不論對基因組還是本發明的陽性標準分子都能檢測出陽性信號。豬18SrRNA基因檢出的Ct值為豬基因組14個循環，陽性標準分子10個循環，陰性樣本則沒有信號，見圖7；豬線粒體COXI基因檢出的Ct值為豬基因組23個循環，陽性標準分子13個循環，陰性樣本沒有信號，見圖8；牛18SrRNA基因檢出的Ct值為牛基因組18個循環，陽性標準分子13個循環，陰性樣本沒有信號，見圖9；牛線粒體BCOXI基因檢出的Ct值為牛基因組15個循環，陽性標準分子8個循環，陰性對照沒有信號，見圖10；鴨18SrRNA基因檢出線粒體基因檢出的Ct值為鴨基因組18個循環，陽性標準分子32個循環，陰性樣本沒有信號，見圖11，線粒體基因檢出的Ct值為鴨基因組19個循環，陽性標準分子26個循環，陰性樣本沒有信號，見圖12。同時對陰性樣本進行檢測，均沒有信號，說明本發明制備的陽性標準分子能被特異性的引物和探針檢測到，具有很好的特異性。

2.3 靈敏度測試結果

對陽性標準分子進行10倍梯度稀釋（10-1至10-7），采用表2中的探針進行實時熒光PCR檢測，反應體系及反應條件同特異性檢測相同，每個反應重復6次。建立標準曲線，根據檢測擴增效率和相關系數分析陽性標準分子的均勻性。

總體看來，所有目標基因曲線拐點清楚，指數增長期明顯，基線平穩[8]。擴增曲線的平行性和重復性均較為理想，基線起峰范圍適當[9]，各檢測結果都在合適的Ct值（即cycle threshold，反應管內的熒光信號到達設定閾值所經歷的循環數，是判斷檢測結果的重要指標。）之間，同時也保證了定量結果的準確性[10]。

檢測結果發現，當3種質粒濃度從100 ng/μL～10-4ng/μL時，均可在40個循環內出現實時熒光PCR顯著擴增曲線。通常認為，當檢測Ct值小于35時可判斷實時熒光PCR檢測結果為陽性，以能夠測出樣品最低模板濃度為相應反應的檢測下限。結果如圖13～圖15所示，表明豬陽性標準分子的最低檢測值達到10-5稀釋度，牛、鴨陽性標準分子的最低檢測靈敏度達到10-4，說明本發明制備的陽性標準分子靈敏度較高。

圖13 豬陽性標準分子靈敏度檢測結果Fig.13 Sensitivity test results of pig positive standard molecular

圖14 牛陽性標準分子靈敏度檢測結果Fig.14 Sensitivity test results of bovine positive standard molecular

圖15 鴨陽性標準分子靈敏度檢測結果Fig.15 Sensitivity test results of duck positive standard molecular

2.4 穩定性測試結果

一般短期穩定性研究4周～8周，長期穩定性進行6個月或1年。按ISO導則35關于穩定性評價的方法對標準物質的短期穩定性和長期穩定性進行評價。

將構建的標準分子置于室溫25℃條件下，放置兩個月，進行實時熒光PCR檢測，對獲得的Ct值進行統計分析標準分子的穩定性。對每次實時熒光測試每個反應6個重復的Ct值平均值進行相對標準偏差分析結果見表3～表5，結果表明室溫條件下陽性標準分子儲存1周后才開始出現顯著性差異，而這種顯著性差異在陽性標準分子儲存超過一月后消失。因此推斷本試驗構建的陽性標準質粒分子熱穩定性較好，不易降解。

表3 豬陽性標準分子穩定性結果Table 3 Stability results of pig positive standard molecule

表4 牛陽性標準分子穩定性結果Table 4 Stability results of bovine positive standard molecule

表5 鴨陽性標準分子穩定性結果Table 5 Stability results of duck positive standard molecule

3 結論

近年來，隨著分子生物學技術在食品檢測方面的廣泛應用，各大實驗室和研究機構都積極致力于靈敏度更高、效率更高、更準確的實時熒光PCR反應[11]。本研究通過分析豬、牛、鴨物種特有的18SrRNA基因和線粒體基因序列，構建了3個適于檢測豬、牛、鴨源性物質的陽性標準分子，并對3種陽性標準分子的特異性、靈敏度和穩定性進行了驗證，該陽性標準分子不需要依賴于豬、牛、鴨材料的供應，可促進檢驗基礎薄弱、技術能力有限的食品檢驗機構動物源性成分檢測能力的提升，解決了食品監管工作中缺乏陽性對照的難題。研究成果的應用推廣將對保障我國食品安全監督監管發揮重要的作用，對于肉及肉制品中動物源性成分準確可靠的鑒定具有重要意義和良好的應用前景。

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