2株海洋紅酵母突變菌株對小鼠的毒性試驗

劉 影，謝為天，吳 娟，徐春厚

(廣東海洋大學農學院，廣東湛江 524088)

海洋紅酵母是指存在于海洋環境及海洋生物中的單細胞真核微生物。國外研究表明，在深海火山以及一些受污染海域、太平洋、印度西南海岸、南極等不同的海域中，紅酵母均為優勢菌群[1-5]。海洋紅酵母富含蛋白質、氨基酸、脂肪酸、類胡蘿卜素、蝦青素、消化酶、維生素、核苷酸等，具有較高的營養價值和活性作用，可作為食品添加劑、功能生物飼料、抗氧化劑、微生物拮抗劑及著色劑等應用[6-10]。

海洋紅酵母作為微生態制劑應用時，能顯著提高水產動物幼苗的存活率，提高飼料效果和飼料報酬，并能增強動物體的免疫功能，減少抗生素用量，是生態養殖的優良添加劑[11]。攝食添加海洋紅酵母飼料的水產動物具有抗病能力強、存活率高、皮膚和肌肉色澤鮮艷、口味好等特點[12]。在海洋紅酵母中，膠紅酵母和粘紅酵母是南海近岸海域的優勢種群[6,13]，含有類胡蘿卜素、蝦青素、消化酶、維生素等活性物質，是具有較高開發價值的益生菌株[6]。筆者選用的膠紅酵母J6-82和粘紅酵母J2-75是從雷州半島近岸海域分離鑒定和誘變選育的2株海洋紅酵母突變菌株，具有營養要求簡單、繁殖速度快、易培養、類胡蘿卜素和蝦青素產量高等優點，具有潛在的應用價值和廣闊的開發前景，故有必要對其進行急性毒性試驗，以期為今后將其作為益生菌株的開發應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1菌株膠紅酵母J6-82和粘紅酵母J2-75，由廣東海洋大學預防獸醫學實驗室分離鑒定、誘變選育和保存。

1.2試驗動物42只SPF級昆明(KM)小鼠，體質量為28～30 g，購于廣東醫學院實驗動物中心。

1.3培養基

1.3.1紅酵母培養基。蛋白胨 20 g/L，酵母膏 10 g/L，葡萄糖 20 g/L，NaCl 20 g/L，pH自然。

1.3.2紅酵母瓊脂培養基。在紅酵母培養基中加入瓊脂粉 20 g/L，pH自然。

1.42株紅酵母菌懸液的制備分別將膠紅酵母J6-82和粘紅酵母J2-75劃線接種于紅酵母瓊脂培養基平板，28 ℃下培養72 h，用滅菌生理鹽水刮下紅酵母菌苔，置于帶玻璃珠的三角瓶中振蕩，用滅菌紗布過濾；使用血球計數板計數紅酵母的菌體細胞數量，配制成細菌數量分別為1×107、1×109和1×1011個/mL的菌懸液。

1.5毒性試驗

1.5.1動物試驗設計。將42只小鼠隨機分成7組，分別為試驗組(①、②、③、④、⑤、⑥)和對照組，每組6只，公母各半，逐只稱重；試驗組①、②、③小鼠灌服膠紅酵母J6-82菌懸液，細菌數量分別1×107、1×109和1×1011個/mL；試驗組④、⑤、⑥小鼠灌服粘紅酵母J2-75菌懸液，細菌數量分別為1×107、1×109和1×1011個/mL；對照組小鼠灌服滅菌的紅酵母培養基；試驗小鼠連續灌服14 d，每天1次，0.5 mL/只；灌服前后分別禁食8和2 h，不禁水，每天對小鼠進行稱重和一般性觀察；第15天，對小鼠進行血常規測定、臟器指數測定、病理解剖學觀察及肝臟組織切片觀察。

1.5.2測定項目與方法。試驗開始后，每天上午、下午各觀察1次，詳細記錄小鼠的外觀體征、采食飲水、中毒癥狀及死亡情況；小鼠在每天灌胃前逐只稱重，記錄重量；詳細記錄每組小鼠的飲水量。

(1)小鼠血常規測定。試驗開始后的第15天(提前12 h禁食)，每組隨機取3只小鼠，摘眼球取血，將血液滴入裝有EDTAIC2抗凝劑的真空采血管中，取血樣約100 μL，使用BC-3000全自動三分群血細胞分析儀進行血常規分析檢測。

(2)小鼠病理解剖學觀察及臟器指數測定。試驗開始后的第15天(提前12 h禁食)，每組取3只小鼠，脫頸椎處死小鼠并將其解剖，觀察有無病變器官，剝離心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟等脂肪和筋膜后稱重，用于測定小鼠臟器指數。

(3)小鼠病理組織學觀察。將用于小鼠血常規測定的14只(每組取2只)小鼠的肝臟制成病理組織切片，用4%甲醛溶液固定，石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅染色，使用光學顯微鏡觀察。

1.6數據處理試驗數據用平均值±標準差表示，使用SAS 8.2統計軟件對試驗數據進行單因子方差分析，差異顯著時進行Duncan’s多重極差比較，P<0.05表示差異顯著性。

2 結果與分析

2.1小鼠一般體征的觀察將2株紅酵母的菌懸液分別按3個不同濃度灌服小鼠，連續觀察14 d，發現所有小鼠均表現為健康活潑的正常狀態，采食和飲水正常，無發病和死亡現象。

2.2小鼠體質量的變化由表1可知，與對照組相比，各試驗組小鼠平均體質量呈增加趨勢，但差異不顯著(P>0.05)，各試驗組間小鼠平均體質量亦無顯著差異(P>0.05)。

表1 各組小鼠平均體質量的變化

2.3小鼠飲水量的變化從圖1可以看出，與對照組相比，各試驗組小鼠的飲水量略有下降，但差異不顯著(P>0.05)；各試驗組間飲水量亦無顯著差異(P>0.05)。

圖1 各組小鼠平均飲水量的比較Fig.1 The comparison of the average amount of drinking water of mice among different groups

2.4小鼠血常規測定結果由表2可知，各試驗組小鼠的淋巴細胞比率和淋巴細胞總數均高于對照組，且存在顯著差異(P<0.05)；粘紅酵母菌J2-75的淋巴細胞比率和淋巴細胞總數均高于膠紅酵母J6-82，且隨著灌服菌數的增多呈增加的趨勢。

2.5小鼠病理解剖學觀察及臟器指數測定結果每組取3只小鼠進行解剖，肉眼觀察各組小鼠主要臟器的形態、顏色、質地、充出血等，均未出現異常變化。由表3和表4可知，各試驗組小鼠的臟器指數與對照組相比差異不顯著(P>0.05)，各組小鼠的臟器指數均在正常值范圍內。

2.6小鼠病理組織學觀察顯微鏡觀察小鼠的肝組織切片，結果見圖2。從圖2可以看出，各試驗組與對照組小鼠的肝組織結構一樣，肝小葉結構清晰完整，中央靜脈及其周圍放射狀排列的肝細胞間緊密聯系，并且彼此連接成網狀，核仁明顯，胞質均勻。

表2 各組小鼠淋巴細胞比率和淋巴細胞總數的比較

表3 膠紅酵母J6-82對小鼠臟器指數的影響(n=3)

注：(a).試驗組①；(b).試驗組②； (c).試驗組③；(d).試驗組④；(e).試驗組⑤；(f).試驗組⑥；(g).對照組Note：(a).test group ①;(b).test group ②;(c).test group ③;(d).test group ④;(e).test group ⑤; (f).test group ⑥;(g).control group 圖2 各組小鼠肝組織切片觀察(400×) Fig.2 The observation of liver tissue of mice in each group(400×)

表4 粘紅酵母J2-75對小鼠臟器指數的影響(n=3)

3 討論

在小鼠毒性試驗中，將3個不同濃度的膠紅酵母J6-82和粘紅酵母J2-75菌懸液灌服小鼠，連續灌服14 d。在此期間，各試驗組小鼠均呈健康活潑狀態，無發病、死亡現象，體質量變化和飲水量正常，無病理解剖學變化；各試驗組小鼠的心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟指數與對照組相比無顯著差異，說明2株紅酵母對小鼠無急性毒副作用；各試驗組小鼠的淋巴細胞比率和淋巴細胞總數均顯著高于對照組，說明這2株紅酵母能夠增強小鼠機體的免疫力，且粘紅酵母菌J2-75具有更強的提高免疫力的作用。

徐占利等[14]用篩選出的膠紅酵母菌株進行了急性毒性及遺傳性毒性研究，采用急性經口毒性試驗、Ames試驗、小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核試驗及小鼠精子畸形試驗對膠紅酵母進行安全性評價，結果表明膠紅酵母菌屬于安全無毒性，并且未見其遺傳毒性。該試驗結果亦證實了膠紅酵母J6-82和粘紅酵母J2-75突變菌株對小鼠無急性毒性，至于是否有遺傳性毒性尚有待于進一步研究。

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