蘭州百合褐腐病罹病根和根盤及鱗片分出的真菌和卵菌

白 濱 ，何蘇琴 ，于安芬 ，荊卓瓊 ，李瑞琴 ，徐 瑞 ，柳利龍

（1.甘肅省農(nóng)業(yè)科學院畜草與綠色農(nóng)業(yè)研究所，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測技術(shù)研究所，甘肅 蘭州 730070；3.農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風險評估實驗室（蘭州），甘肅蘭州 730070；4.甘肅省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所，甘肅 蘭州 730070；5.農(nóng)業(yè)部天水作物有害生物科學觀測實驗站，甘肅 天水 741200）

蘭州百合［Lilium davidii var.willmottiae（E.H.Wilson）Raffill］是川百合的一個變種［1］，具有食用、藥用、保健和觀賞價值。蘭州百合不僅是中國百合中的上品，而且是中國唯一的甜百合，享有“蘭州百合甲天下”的美譽。蘭州栽培百合的歷史已有400多年，作為蘭州市最具特色的農(nóng)產(chǎn)品之一，歷經(jīng)數(shù)百年的發(fā)展，蘭州百合已經(jīng)成為產(chǎn)區(qū)農(nóng)民擺脫貧困、增加收入的支柱產(chǎn)業(yè)［2-5］。目前，蘭州百合種植面積在6 667 hm2以上，年產(chǎn)量3 000 萬～4 000 萬 kg［6］。

蘭州百合的種植區(qū)域集中且生產(chǎn)周期較長（從母籽培育到形成商品百合一般需要5～6 a），輪作倒茬困難，隨著種植面積的擴大和種植年限的延長，百合根和鱗莖褐腐病日趨嚴重，嚴重影響了蘭州百合的產(chǎn)量和質(zhì)量。由于受侵染部位不同，可產(chǎn)生根腐、根盤腐爛和鱗片腐爛等多種癥狀：鱗片上單個病斑圓形、黃褐色至黑褐色，稍隆起至明顯凹陷，一些病斑在鱗片上形成穿孔，病斑直徑1～5mm，可相連成片，嚴重時外面的1～2層鱗片完全變黑腐爛；根盤受害呈黃褐色至黑褐色；病根呈污黃、黃褐或黑褐色（見封三圖1）。

由于百合種類、種植區(qū)域、栽培方式及生態(tài)條件的不同，百合根和鱗莖褐腐（斑）病的病原種類也存在較大差異。在北美和加拿大，Colletotrichum dematium、Fusarium oxysporum f.sp.lilii和Cylindrocarpon radicicola是引起百合鱗莖腐爛的主要病原［7-9］；在荷蘭，Bollen［10］于 1971—1975年對采自23塊百合田塊的病害標樣進行了分離，Cylindrocarpon sp.的分離頻率在50.3%～51.0%，F(xiàn)usarium oxysporum的分離頻率在35.1%～38.7%，Penicillium corymbiferum的分離頻率在4.3%～19.7%，Sistotrema sp.的分離頻率在6.6%～18.4%，且Penicillium corymbiferum和Sistotrema sp.在地下莖和鱗片上的分離頻率明顯不同；在西班牙，F(xiàn)usarium oxysporum f.sp.lilii和Fusarium proliferatum可引起百合葉片黃化和落葉，根和鱗莖產(chǎn)生壞死斑，甚至植株矮化和死亡［11］；在以色列，引起百合根腐和鱗莖腐爛的病原包括Rhizoctonia AG-A，Rhizoctonia solani， Pythium oligandrum， Fusarium proliferatum和F.oxysporum［12］。我國報道的可引起百合生長期根和鱗莖腐爛的病原菌有Botrytis elliptica， Colletotrichum liliacearum， Fusarium moniliform，F(xiàn)usarium oxysporum，F(xiàn)usarium solani，F(xiàn)usarium tricinctum，Penicillium cyclopium，Phytophthora parasitica， Pythium sp.， Rhizoctonia solani，Sclerotium rolfsii等［13-22］。

為了探明蘭州百合褐腐病相關(guān)真菌和卵菌種類，給病害科學防治提供技術(shù)支撐，我們于2013年秋季在蘭州百合主產(chǎn)區(qū)采集標樣，對蘭州百合褐腐病罹病根、根盤和鱗片組織進行了組織分離，對分出真菌和卵菌的優(yōu)勢種群進行了分析，并對部分菌株的致病性進行了測定，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 標樣采集

于2013年9月在蘭州百合主產(chǎn)區(qū)的5個樣點采集罹病百合標樣。標樣標記后置于保鮮袋中，帶回實驗室后立即攤晾開，在48 h之內(nèi)對標樣進行組織分離。標樣采集明細見表1。

1.2 培養(yǎng)基

培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA），配方為馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂12 g，水1 000mL，pH自然。

1.3 真菌和卵菌的分離、純化及保藏

采用常規(guī)的真菌組織分離法進行分離［23］。將罹病鱗片和根盤組織剪成0.5cm×0.5cm的小塊，根剪成長1cm左右的小段，用70%乙醇表面消毒5～10 s，再用滅菌水沖洗4～5次，置PDA平板上，20～22℃黑暗培養(yǎng)，長出的真菌及時純化保藏。

1.4 真菌和卵菌的鑒定

采用傳統(tǒng)的形態(tài)分類鑒定方法，依據(jù)分出真菌和卵菌的培養(yǎng)特征和顯微形態(tài)特征，鑒定到屬。分類鑒定參考的主要文獻包括《真菌鑒定手冊》［24］，Illustrated genera of imperfect fungi［25］，Delimitation ofNeonectria and Cylindrocarpon （Nectriaceae，Hypocreales， Ascomycota） and related genera with Cylindrocarpon-like anamorphs等［26］。

1.5 分離結(jié)果統(tǒng)計

以分出率衡量罹病組織中真菌和卵菌的豐富程度及每個組織塊受多重侵染的發(fā)生頻率。分出率（isolation rate）為分離到的某一類型真菌和卵菌的菌株數(shù)占分離樣品組織塊總數(shù)的百分率，以分離頻率比較判斷優(yōu)勢菌群。分離頻率（isolation frequency）為分離到的某一類型真菌和卵菌的菌株數(shù)占分離總的真菌和卵菌菌株數(shù)的百分率［27］。

表1 罹病百合標樣采集明細

1.6 部分菌株的致病性測定

在分出真菌的3個優(yōu)勢菌群中，選擇代表性的9個菌株為測試菌株。待測絲核菌屬（Rhizoctonia）菌株在PDA平板上20℃黑暗培養(yǎng)3 d，在菌落邊緣取直徑5mm菌絲塊，接種于健康的蘭州百合鱗片和小鱗莖上，每菌株接種10枚百合鱗片和6枚小鱗莖，每枚鱗片接種1塊菌絲塊，在每枚小鱗莖的根盤和根部接種2～3塊菌絲塊，以不接菌的蘭州百合鱗片和小鱗莖為對照，放置在直徑20cm的培養(yǎng)皿內(nèi)、室溫（20℃）下保濕培養(yǎng)。土赤殼屬（Ilyonectria）和鐮刀菌屬（Fusarium）待測菌株在PDA平板上20℃黑暗培養(yǎng)7～10 d，在菌落邊緣取直徑5mm的菌絲塊，接種于健康的蘭州百合鱗片上，每菌株接種10枚百合鱗片，每枚鱗片接種1塊菌絲塊，以不接菌的蘭州百合鱗片為對照，置直徑20cm培養(yǎng)皿內(nèi)、室溫（20℃）下保濕培養(yǎng)。小鱗莖接種后7 d、鱗片接種后35 d統(tǒng)計發(fā)病率，對發(fā)病的百合組織進行病原菌重分離。

2 結(jié)果與分析

2.1 分出真菌和卵菌的組成

從表2可以看出，從5個樣點采集的罹病百合標樣中共分離得到真菌和卵菌574株，鑒定后歸于6個屬，少數(shù)不產(chǎn)孢真菌或疑難菌暫歸為其他。在屬的水平上，以土赤殼屬（Ilyonectria）、鐮刀菌屬（Fusarium）和絲核菌屬（Rhizoctonia）為優(yōu)勢菌群，分別占總菌株數(shù)的46.86%、32.23%、17.07%。病組織塊的真菌和卵菌分出率為100.00%～134.78%，從1塊病組織上分出1種以上菌類的現(xiàn)象普遍。

2.2 優(yōu)勢菌群在不同地塊間的差異

從表3可以看出，3個優(yōu)勢菌群在不同地塊的差異明顯。不同地塊間土赤殼屬（Ilyonectria）的分離頻率為18.92%～85.85%，分出率為19.44%～91.00%；鐮刀菌屬（Fusarium）的分離頻率為1.75%～58.02%，分出率為1.83%～66.67%；絲核菌屬（Rhizoctonia）的分離頻率為2.83%～45.61%，分出率為3.00%～47.71%。3個優(yōu)勢菌群在不同地塊分出真菌和卵菌中的占比差異與采樣地塊的土壤含水量間無線性關(guān)系。

2.3 優(yōu)勢菌群在不同分離部位的差異

從表4可以看出，3個優(yōu)勢菌群在罹病百合不同部位分出真菌和卵菌中的占比差異明顯，土赤殼屬（Ilyonectria）在鱗片和根上的分出率和分離頻率較高，鐮刀菌屬（Fusarium）在根盤上的分出率和分離頻率最高，而絲核菌屬（Rhizoctonia）的在根盤和根上的分出率和分離頻率明顯高于鱗片。

表2 百合褐腐病分出真菌和卵菌的類群組成①Bot、Ily、Fus、Pen、Pyt、Rhi分別為Botrytis、Ilyonectria、Fusarium、Penicillium、Pythium、Rhizoctonia的縮寫，下同。

表3 不同地塊百合褐腐病分出真菌和卵菌優(yōu)勢菌群的差異

表4 百合褐腐病不同部位分出真菌和卵菌優(yōu)勢菌群的差異

2.4 試驗菌株對蘭州百合的致病性

測試的9個菌株中有7個菌株對蘭州百合具有致病性。對發(fā)病的百合組織進行病原菌的重分離，原接種菌的分出率達100%（見表5、封三圖2）。

表5 試驗菌株對蘭州百合的致病性

3 小結(jié)與討論

百合屬植物大約有115種，主要分布于北半球的溫帶和高山地區(qū)，特別是東亞地區(qū)，我國有55種［1］。關(guān)于蘭州百合的學名，除Lilium davidii var.willmottiae（E.H.Wilson）Raffill外［1］，使用較多的還有 Lilium davidii var.unicolor Cotton［25］，Lilium davidii var.unicolor Salisb 等［29-30］，這些名稱間的關(guān)系如何，期待相關(guān)的植物分類學工作者進行梳理和規(guī)范使用。

本研究中，土赤殼屬［Ilyonectria（Cylindrocarpon-like anamorphs）］、鐮刀菌屬（Fusarium）和絲核菌屬（Rhizoctonia）3類菌的分出頻率分別為46.86%、32.23%和17.07%，總的分出頻率達96.17%，與李誠［14］1990—1993年對采自蘭州市和平?jīng)鍪械奶m州百合的分離結(jié)果（Fusarium oxysporum，F(xiàn)usarium solani和Fusarium moniliform 3種鐮刀菌總的分離比率達84%）相比較，差異較大；與 Bollen［10］1971—1975 年對采自荷蘭的 23 塊百合田塊的病害標樣的分離結(jié)果（Cylindrocarpon sp.的分離頻率達50.3%～51.0%）有部分相似。

土赤殼屬（Ilyonectria）大多數(shù)種類為植物病原菌，可引起植物根腐病和黑腐病等［31］，其無性型柱孢屬（Cylindrocarpon Wollenw.）真菌是人參、西洋參和三七等藥用植物根腐（銹腐）病的主要病原菌［32-36］。

本研究中，土赤殼屬［Ilyonectria（Cylindrocarpon-like anamorphs）］的3個菌株、鐮刀菌屬（Fusarium）的2個菌株和絲核菌屬（Rhizoctonia）的2個菌株對蘭州百合的致病性得到確認，但由于不同種類病菌的致病條件存在差異，在同一條件下對試驗菌株致病性的測定結(jié)果并不能完全反映其致病力強弱。分出真菌和卵菌的種的鑒定，在不同溫濕度條件下和對寄主不同組織部位的致病性，以及非致病種類與致病菌的關(guān)系等，都有待于進一步開展細致的研究工作。

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