益髓灸對D-半乳糖致衰老小鼠學習記憶及氧化應激水平的影響

黃新格 零佩東 羅志洪 蘇傳麗 趙利華 陳尚杰

(1 廣西中醫藥大學第一附屬醫院壯醫科，南寧，530023； 2 廣西南寧市第一人民醫院康復科，南寧，530001； 3 廣西中醫藥大學研究生院， 南寧，530001； 4 廣西中醫藥大學第一附屬醫院病理科，南寧，530023； 5 廣西中醫藥大學第一附屬醫院針灸科， 南寧，530023； 6 南方醫科大學附屬深圳寶安醫院，深圳，518101)

氧化應激(Oxidative Stress，OS)被認為是與多種腦衰老相關的神經退行性疾病發病過程中的重要因素之一[1]。故抗OS損傷已成為改善與腦衰老相關的神經退行性疾病的新思路及新靶點。針灸在腦衰老的預防及治療方面均有獨特的優勢。有關研究[2-4]證實艾灸的燃燒物具有抗氧化能力，本研究通過觀察益髓灸對D-半乳糖模型小鼠學習、記憶能力及OS水平的影響，比較足三里配懸鐘、百會配關元2組穴位處方抗氧化延緩腦衰老的效應，現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 健康3月齡昆明雄性小鼠75只，體質量(30±2)g，均由廣西醫科大學動物中心SPF實驗室提供(動物許可證號:SCXK桂2003-0003)。用Morris水迷宮實驗篩選神經發育、學習記憶功能正常、游泳距離不低于2 600 cm/2 min、體質量不低于28 g健康雄性小鼠75只，按隨機數字表隨機分為5組，15只/組，即：生理組、造模組、艾灸1組(足三里+懸鐘穴)、艾灸2組(百會+關元穴)，艾灸3組(非穴位)。各組小鼠飼養條件均相同，飼養于廣西中醫藥大學實驗動物中心SPF級實驗室(合格證號：桂E動字第11004號)，室溫保持在(24±2) ℃，相對濕度65%，12 h晝夜交替，自由攝食和飲用純凈水。

1.1.2 藥物 精制艾絨(蘇州東方艾絨廠)；D-半乳糖(國藥集團(上海)化學試劑有限公司，批號：20131105)；生理鹽水(貴州天地藥業有限責任公司，批號：A14051104)。

1.1.3 試劑與儀器 4%多聚甲醛固定液、1xPBS磷酸鹽緩沖液(武漢博士德生物工程有限公司，批號：AR1069、AR0030)；小鼠8-羥基脫氧鳥苷酸(8-OHdG)、小鼠總抗氧化能力(T-AOC)酶聯免疫測定試劑盒(上海聯碩生物科技有限公司，批號：DRE660Mu 201412、DRE006Mu 201412)。泰盟TM-Vision實驗行為學Morris水迷宮系統(北京中科院生理所)；電子天平(FA2204B型，上海精天美科學儀器有限公司)；海爾超低溫保存箱(DW-86L490型，國產)；Thermo Fisher Scientific離心機(Sorvall ST16型，德國)；電熱恒溫培養箱(DWP-P162，上海精密實驗設備有限公司)；制冰機(YN-80D型，上海因紐特制冷設備有限公司)；脫色搖床(TS-2000A，海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；超聲波信號發生器、超聲波細胞粉碎機隔音箱(上海比朗儀器有限公司)；純水儀(Aqualix-5型，美國)；全波長酶標儀(EPOCH BIOTEK型，美國)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 參照文獻[5-7]配制D-半乳糖溶液，將D-半乳糖試劑與生理鹽水按10 g∶100 mL混勻為100 mg/mL。水迷宮行為測試后，造模組、艾灸1組、艾灸2組、艾灸3組頸背部皮下注射D-半乳糖1 000 mg/(kg·d)(相當于每10 g體質量注射0.l mL濃度為10%的D-半乳糖溶液)，同時生理組以同法每10 g體質量注射0.l mL劑量的生理鹽水，連續56 d。

1.2.2 干預方法 造模第13 d起，各觀察組開始艾灸治療，3壯/次·穴，灸單側(或2穴)，共6壯。時間為每天上午10:00—12:00,下午3:00—4:30。治療1次/d，共44次。艾灸1組穴位為“足三里”“懸鐘”，其中足三里先灸，懸鐘后灸，單日灸左側，雙日灸右側；艾灸2組穴位為“百會”“關元”，其中百會先灸，關元后灸；艾灸3組灸腕背關節上1 mm(簡稱腕上)和膝髕正中上沿上2 mm(簡稱髕上)，其中腕上先灸，髕上后灸。小鼠穴位定位參考林文注《實驗針灸學》和胡元亮《實驗動物針灸手冊》[8-9]，“足三里”取小鼠膝關節下方，腓骨小頭下0.3 cm處肌溝中；“懸鐘”取后肢腓骨后緣處，外踝尖直上0.5 cm；“百會”位于頂骨正中處，約兩耳連線中點前0.2 cm,“關元”位于腹正中線臍下1 cm處。艾灸前先將穴位處剪毛，涂少量凡士林粘固艾炷并防止小鼠皮膚燒傷。將艾炷點燃，灸至小鼠掙扎時更換，每壯約18～20 s，灸完后用棉簽按壓穴位。艾炷制作要求緊而結實，底座直徑1.5 mm，高6 mm，重約12～14 mg。生理組和造模組只給予與各觀察組同時間、程度的捉抓刺激，不做治療性干預。

1.2.3 檢測指標與方法 用水迷宮實驗測定小鼠的學習記憶力。先進行5 d的定位航行試驗，觀察潛伏期、平臺象限百分比、停留時間、尋求次數。最后進行1 d的空間探索實驗，觀察原平臺象比(簡稱“原象比”)、跨越平臺次數(簡稱“跨臺次數”)。以上指標均能綜合反映出小鼠的學習、記憶及運動行為能力。治療結束(即艾灸滿44次)，進行水迷宮再測試后，將各組小鼠眼球取血，低溫離心機3 000 r/min離心20 min，收集血清上清液，樣本置-20 ℃保存，待測。斷頭取腦，開腹取腎，按試劑說明書制備10%的腦、腎組織勻漿，以2 500 r/min低溫離心10～15 min，提取上清液，樣本置-20 ℃保存，待測。血清及腦、腎組織勻漿8-OHdG、T-AOC含量的測定均采用酶聯免疫吸附(ELISA)實驗技術，嚴格按試劑盒說明書要求測各項指標。

2 結果

2.1 實驗前后Morris水迷宮學習記憶行為測定 結果顯示：1)造模、治療前各組在定位航行、空間探索各指標差異不顯著，提示各組小鼠的學習記憶能力一致，無差別。2)造模、治療后，造模組與生理組、艾灸1組、艾灸2組比較，“潛伏期、平臺象比、停留時間、尋求次數、原平臺象限百分比、跨越次數”6項指標，差異均有統計學意義(P<0.05)，與艾灸3組比較，差異無統計學意義(P>0.05)；生理組與艾灸1組、艾灸2組比較，差異無統計學意義(P>0.05)，與艾灸3組比較，差異有統計學意義(P<0.05)；艾灸1組與艾灸2組比較，差異無統計學意義(P>0.05)；艾灸3組與艾灸1、2組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1～2。

2.2 益髓灸對D-半乳糖衰老小鼠OS水平的影響

2.2.1 益髓灸對D-半乳糖衰老小鼠8-OHdG的影響 結果顯示，造模組血清和腦、腎組織8-OHdG含量較生理組、艾灸1組和艾灸2組顯著升高,差異有統計學意義(P<0.01)，與艾灸3組比較，差異無統計學意義(P>0.05)；生理組與艾灸1組、艾灸2組比較，差異無統計學意義(P>0.05)，與艾灸3組比較，差異有統計學意義(P<0.05)；艾灸1組與艾灸2組比較，差異無統計學意義(P>0.05)；艾灸3組與艾灸1、2組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

2.2.2 益髓灸對D-半乳糖衰老小鼠T-AOC的影響 結果顯示，造模組血清和腦、腎組織T-AOC水平較生理組、艾灸1組和艾灸2組顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)，與艾灸3組比較，差異無統計學意義(P>0.05)；生理組與艾灸1組、艾灸2組比較，差異無統計學意義(P>0.05)，與艾灸3組比較，差異有統計學意義(P<0.05)；艾灸1組與艾灸2組比較，差異無統計學意義(P>0.05)；艾灸3組與艾灸1、2組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表1 造模及治療前水迷宮各項指標記錄結果

注：與造模組比較，*P<0.05；與生理組比較,△P<0.05;與艾灸3組比較，▲P<0.05

表2 造模及治療后水迷宮各項指標紀錄結果

注：與造模組比較，*P<0.05;與生理組比較,△P<0.05;與艾灸3組比較，▲P<0.05

表3 益髓灸對D-半乳糖衰老小鼠8-OHdG的影響

注：與造模組比較,*P<0.05;與生理組比較，△P<0.05;與艾灸3組比較,▲P<0.05

表4 益髓灸對D-半乳糖衰老小鼠T-AOC的影響

注：與造模組比較，*P<0.05;與生理組比較，△P<0.05;與艾灸3組比較，▲P<0.05

3 討論

中醫學認為，腦衰老病位在腦，病機為腦髓失養。《醫林改錯》記載“高年無記性者，腦髓漸空。”OS是腦損傷、認知功能障礙甚至老年性癡呆等腦衰老相關疾病的重要誘因[10]。而由OS導致的腦功能減退在一定程度上屬于“腦衰老”范疇[11]。

活性氧簇(Reactive Oxygen Species，ROS)是機體內一類活性含氧化合物的總稱，主要包括超氧陰離子基團、過氧化氫自由基、羥自由基等。在疾病或某些外源性物質刺激下，ROS快速釋放并在體內過度蓄積，OS超出機體抗氧化能力，進而造成DNA的氧化損傷[12]。DNA氧化損傷與老化相關退行性疾病，如癌癥、心血管疾病、糖尿病等密切相關[13]。8-OHdG是ROS致DNA氧化損傷的產物，因其特異性強、結構穩定、容易釆集等特點，已被公認為最能反映機體DNA氧化損傷的理想生物指標，在OS領域內被廣泛采用[14]。體內總抗氧化能力(Total Antioxidant Capacity，T-AOC)可全面的反映了酶與非酶整個防御體系的抗氧化能力，是一個全面反映機體抗氧化力的良好指標[15]。研究證實，機體整體抗氧化能力的高低與T-AOC含量成正比[16]。

針灸抗氧化延緩腦衰老的近代研究已取得一定進展，但大多數多局限于常見的OS標志物上，如SOD、CAT、GSH等[17-18]。而進一步從分子蛋白角度探討針灸的抗氧化損傷機制較少，且對抗衰老選穴的橫向比較研究少見，基于此，本研究以益髓灸處方為研究對象，將艾灸1組(足三里+懸鐘)和艾灸2組(百會+關元)2組穴位處方比較觀察，結果示2組各指標組間比較，差異無統計學意義(P>0.05)，提示2組穴位都可從抗OS損傷角度發揮抗衰老作用，故臨床應用時可交替使用。但多數指標中艾灸1組良性趨勢較明顯，其原因可能是：懸鐘為髓會，《難經疏》曰：“髓病治此”；懸鐘為膽經穴位，膽經“主骨所生病”，而腎主骨，骨生髓，故懸鐘可補骨(腎)生髓。足三里為胃經的土穴，脾胃為后天之本，有健脾益氣之功。故兩穴合用可脾腎雙補，健脾補腎生髓。百會屬督脈，為髓海之氣傳輸之處，《靈樞·海論》指出：“腦為髓之海，其輸上在其蓋，下在風府。”其中“蓋”為百會穴，其與腦髓關系極其密切。關元屬任脈，為元陰元陽關藏之所，足三陰與任脈交會于此，故關元既可補益肝脾腎三臟，又可調節全身陰經之氣。2穴合用可調和任督，補脾益腎生髓。綜上所述，艾灸1組和艾灸2組2組穴位處方都可健脾補腎生髓，在抗氧化相關指標上前者更顯良性趨勢，因懸鐘穴使其補腎作用更強，而具體機制還需進一步深入研究。艾炷灸非穴位雖在一定程度上改善了衰老小鼠的學習記憶功能，但大部分指標僅呈現改善趨勢，未體現統計學意義，其原因可能是由于艾炷灸時對局部皮膚的灸灼而引起生物物理效應[19]。

本研究結果提示，益髓灸防治腦衰老的作用機制可能是通過降低D-半乳糖誘導的8-OHdG表達，抑制細胞的DNA損傷，提高機體T-AOC，發揮抗OS損傷的作用來實現的，其中“足三里+懸鐘”較“百會+關元”良性趨勢更明顯，具體機制還有待進一步研究。

[1]保志軍,竺越,陸佩芳,等.衰老與AD同時平行研究的重要性[J].中國老年學雜志,2011,31(6):2131-2133.

[2]劉鈞天,黃暢,劉耀萌,等.艾灸各因素對APP/PS-1雙轉基因AD小鼠腦中DNA、蛋白質、脂質氧化應激的影響[J].中華中醫藥雜志，2015,30(5):1375-1379.

[3]王彩霞.針灸對亞急性衰老模型小鼠皮膚的抗衰老作用研究[J].中國中醫基礎醫學雜志,2014,20(11):1544-1546.

[4]容賢冰,鄧武裝,蔣曉明,等.艾灸足三里穴與關元穴對訓練小鼠免疫功能的影響[J].重慶醫學，2014,43(17):55-57.

[5]龔國清,徐本.小鼠衰老模型研究[J].中國藥科大學學報,1991,22(2):101-103.

[6]竺平暉.鷹嘴豆異黃酮提取物對D-半乳糖致衰老小鼠學習記憶能力的影響[J].中草藥,2011,42(5):969-971.

[7]張瑩瑩,王銀環,史亞,等.金銀花水煎劑對D-半乳糖致衰老模型小鼠的抗氧化作用[J].浙江中醫藥大學學報,2014,8(3):321-326.

[8]林文注,王佩.實驗針灸學[M].上海:上海科學技術出版社,1999:87.

[9]胡元亮.實用動物針灸手冊[M].2版.北京:中國農業出版社,2003:379.

[10]Haddadi M，Jahromi SR，Sagar BK,et al.Brain aging, memory impairment and oxidative stress：a study in drosophila melanogaster[J].behav brain res,2014,259(2)：60-69.

[11]黃新格,零佩東,趙利華.D-半乳糖AD模型與中醫腦衰老證候病機關系的探討及在針灸防治腦衰老中的應用[J].世界中醫藥,2015,10(12):1983-1986.

[12]Jones DP.Radical-free biology of oxidative stress[J].The American Journal of Physiology-Cell Physiology,2008,295(4)：849-868.

[13]陳春,于嘉屏.8-羥基-2-脫氧鳥苷檢測方法及其臨床意義研究進展[J].國際檢驗醫學雜志，2015,36(21):3145-3146.

[14]趙虹,駱慶,和殷明,等.氧化應激與阿爾茨海默病[J].中國老年學雜志,2013,33(16):4090-4093.

[15]劉磊,孟春陽,李鵬,等.鋅對脊髓缺血再灌注損傷大鼠ATP酶、MAO活性和T-AOC含量影響的研究[J].中國實驗診斷學,2015,19(1):10-13.

[16]徐紅艷,劉富國,于陽陽,等.東北山核桃仁油對D-半乳糖衰老小鼠抗氧化能力的影響[J].食品學,2012,33(7)：266-269.

[17]Yu YP，Ju WP，Li ZG,et al.Acupuncture inhibits oxidative stress and rotational behavior in 6-hydroxydopamine lesioned rat[J].Brain Research,2010,1336(6)：58-65.

[18]Zhang X,Wu B,Nie K，et al.Effects of acupuncture on declined cerebral blood flow，impaired mitochondrial respiratory function and oxidative stress in multi-infarct dementia rats[J].Neurochemistry International，2014,65(1):23-29.

[19]陳麗蓉,潘小霞,陳明明,等.朱璉針刺興奮法對缺血性腦損傷幼鼠腦組織氧化應激的影響[J].國際中醫中藥雜志,2016,38(3)：238-241.

[20]陳春蘭,施征.化膿灸法臨床應用及研究概況[J].河南中醫,2013,33(2):262-265.