茶樹CsWRKY3基因的克隆及表達分析

戈林剛+葉保華+辛肇軍+孫曉玲

摘要：WRKY轉錄因子家族普遍存在于植物體內，對植物的多種生理過程有廣泛的調控作用，在眾多植物轉錄因子家族中占有重要地位。本研究從茶樹中克隆獲得一個WRKY基因，命名為CsWRKY3，該基因包含一個1 710 bp的開放讀碼框，編碼569個氨基酸。qRT-PCR結果顯示，CsWRKY3在茶樹根、葉、花中的表達水平較高，在莖、種子中的表達水平較低。當茶樹葉片受到機械損傷或者被茶尺蠖幼蟲取食時，CsWRKY3基因被迅速誘導且表達差異顯著。本研究表明CsWRKY3轉錄因子基因參與了茶樹的抗蟲防御反應。

關鍵詞：WRKY轉錄因子；茶樹；茶尺蠖；機械損傷；抗蟲防御

中圖分類號：S571.1：Q785文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2018）01-0001-08

Abstract WRKY transcription factor family exists widely in plants and has a wide range of regulation effects for a variety of physiological processes in plants， and occupys a very important position in plant transcription factor family. In this study， a WRKY gene， designated as CsWRKY3， was cloned from tea plants， and the open reading frame of CsWRKY3 was 1 710 bp， which encoded 569 amino acids. The results of real-time PCR showed that CsWRKY3 was highly expressed in roots， leaves and flowers， but was weakly expressed in stems and seeds. CsWRKY3 was quickly induced and expressed significantly when the leaves of tea plant were damaged by mechanical damage or eaten by the Ectropis obliqua larvae. This study showed that the CsWRKY3 was involved in defense response against insect pests of tea.

Keywords WRKY transcription factor； Camellia sinensis； Ectropis obliqua； Mechanical damage； Defense against insect pests

WRKY是一類僅存在于高等植物中的轉錄因子[1]。WRKY轉錄因子具有兩個重要特征：第一，至少有一個WRKY結構域，該結構域含有約60個氨基酸殘基，且具有WRKYGQK等7個保守序列；第二，在保守序列后含有一段鋅指結構。根據所含WRKY結構域數目和鋅指結構序列的不同，可將WRKY轉錄因子分成三類。含有兩個WRKY結構域且具有C2H2型鋅指結構的為第Ⅰ類；含有一個WRKY結構域且具有C2H2型鋅指結構的為第Ⅱ類；含有一個WRKY結構域且具有C2HC型鋅指結構的為第Ⅲ類[2]。

自1994年Ishiguro等第一次在甘薯中發現該轉錄因子的存在[3]、1996年Rushton等第一次在歐芹中將此轉錄因子命名為WRKY后[4]，研究人員圍繞WRKY做了更深入的研究。研究表明，WRKY轉錄因子依靠自身的WRKY結構域與靶標基因的W-box特異性結合，進而實現對下游基因的調控作用[5]。大量的試驗證明，WRKY轉錄因子參與植物生長和發育的過程，其不僅可以調節植物種子的發育及萌發、影響植物莖稈的生長速度[6]，還對植物衰老的延緩或促進有一定的調節作用[7]。進一步的研究顯示，WRKY轉錄因子的存在與植物抵抗非生物脅迫息息相關[8]。如：水稻（Oryza sativa）含有的OsWRKY11對干旱和高溫脅迫有相應的抵抗作用[9]；OsWRKY47可以調控下游基因的表達提高水稻抵抗干旱的能力[10]；GmWRKY27的存在可以提高大豆（Glycine max）的抗旱性和抗鹽性[11]。除此之外，WRKY轉錄因子還可以調控植物體對病蟲害的抵抗能力[12]。當受到植食性昆蟲的為害后，植物體內WRKY轉錄因子表達水平會發生相應的變化[13]；CmWRKY48在菊花（Chrysanthemum morifolium）防御蚜蟲為害中起到重要作用，過量表達可以抑制蚜蟲群體的增長[14]；水稻OsWRKY89基因的過表達可增強水稻對白背飛虱（Sogatella furcifera）的抗性[15]，OsWRKY53和OsWRKY70基因可以通過調節水稻體內茉莉酸（jasmonic acid， JA）、乙烯（ethylene， ET）、水楊酸（salicylic acid， SA）和過氧化氫（H2O2）的合成來調節水稻對二化螟（Chilo suppressalis）、褐飛虱（Nilaparvata lugens）的抗性[16]。

茶樹（Camellia sinensis）是一種重要的多年生經濟作物，主要種植于亞洲、非洲、拉丁美洲和大洋洲。茶葉中含有豐富的茶多酚等對人體有益的化合物，可有效預防惡性腫瘤的發生，降低心腦血管疾病和神經系統疾病的出現概率[17]。由于生長環境高溫潮濕，茶樹經常受到茶尺蠖（Ectropis obliqua Prout）等害蟲的為害導致減產，嚴重時甚至絕產[18]。雖然WRKY轉錄因子的研究已經相當全面且深入，但是茶樹上WRKY轉錄因子的研究僅局限在WRKY結構分類[19]或其對于高溫等非生物脅迫的抗性方面[20]，鮮有WRKY轉錄因子參與茶樹抗蟲方面的報道。本研究基于茶樹轉錄組數據克隆獲得一個WRKY基因，命名為CsWRKY3，對其進行生物信息學分析，并研究茶尺蠖取食和機械損傷處理茶苗后CsWRKY3的相對表達水平，為研究CsWRKY3調控茶樹抗蟲性提供理論依據。endprint

1 材料與方法

1.1 供試茶苗

以2年生龍井43號扦插苗為供試茶苗，培養于（26±2）℃、光周期12 L∶12 D、相對濕度60%～70%的溫室中，根據茶苗發育情況，每季度施用有機肥一次。選擇長勢較齊整、葉層較平均、無病蟲為害的茶苗用于試驗。

1.2 供試昆蟲

茶尺蠖蛹取自浙江省紹興市御茶村茶業有限公司下轄茶園。室內區分雌雄后，分開飼養于溫度（26±2）℃、光周期12 L∶12 D、相對濕度80%的RXZ智能型人工氣候箱內，以幼嫩茶樹葉片作為食物。成蟲羽化并鑒定品種后，雌雄混養，待室內穩定馴養兩代后，取第三代幼蟲作為試驗用蟲。

1.3 茶苗處理及取樣

1.3.1 茶苗不同組織、不同葉位樣品取材 在溫度（26±2）℃、相對濕度75%的溫室中進行試驗。選取生長狀況相近的茶樹，取根、莖、葉、花、種子五種組織器官，每種5組重復；另分別選取芽下第一、二、三、四葉，每葉位5組重復。取樣后立刻投入液氮并轉移至-80℃超低溫冰箱保存。

1.3.2 茶尺蠖取食處理 在溫度（26±2）℃、相對濕度75%的溫室中進行試驗。選擇發育狀況較均一的3齡茶尺蠖幼蟲（TG）2頭饑餓處理10 h后取食茶苗第二葉位，用規格為7 cm×5 cm的80目透明網袋套住被取食葉片，防止幼蟲逃逸。對照組不做任何處理。待TG取食葉片有明顯缺刻時開始計時，于0、1.5、3、6、12、24、48 h后取樣，每個時間點5個重復，取樣后立刻投入液氮并轉移至-80℃超低溫冰箱保存。

1.3.3 機械損傷處理 在溫度（26±2）℃、相對濕度75%的溫室中進行試驗。用自制機械損傷處理器（用雙面膠包裹10只昆蟲針做成的末端平整的圓柱體）處理茶苗第二葉位，每片處理葉扎200次，對照組不做任何處理。于機械損傷0、0.5、1、2、4、8、12、24、48 h后取樣，每個時間點5個重復，取樣后立刻投入液氮并轉移至-80℃超低溫冰箱保存。

1.3.4 樣品總RNA的提取和cDNA的合成 將所取試驗樣品用高通量研磨儀在液氮環境下進行研磨后，選用RNAprep Pure植物總RNA提取試劑盒（天根生物科技有限公司）提取樣品茶葉總RNA。提取到的RNA用Nanodrop ND2000（上海普元儀器有限公司）進行濃度檢測，用PrimeScript RT reagent Kit（大連寶生物工程有限公司）進行反轉錄，所得cDNA放在-20℃冰箱內待用。

1.4 CsWRKY3基因的克隆

CsWRKY3序列來源于實驗室茶樹轉錄組數據，經ORF finder軟件確定其具有完整的開放讀碼框。基于此，用Primer Premier 5.064設計序列全長引物（WRKY3-F：5′-CACCACCCACCACTCACA-3′；WRKY3-R：5′-AAAACCTTCATACCTCCT-3′），以反轉錄得到的cDNA為模板，對目的基因CsWRKY3進行擴增。擴增總反應體系為20 μL：PrimeSTAR Max DNA Polymerase 12 μL、WRKY3-F和WRKY3-R各1 μL、cDNA 1 μL、ddH2O 5 μL。PCR擴增使用兩步法，程序為：95℃預變性2 min；98℃變性10 s，65℃延伸1 min，30個循環；72℃終延伸5 min。擴增所得的PCR產物經電泳、凝膠回收、加多聚腺苷酸（PolyA）并純化后，連接在pMD19-T載體上，連接成功后將質粒轉化到E.coli DH5α Competent Cells感受態細胞，鑒定陽性克隆后，送南京金斯瑞士生物有限公司測序。

1.5 序列分析

測序所得核苷酸序列ORF的尋找以及同源性分析比對利用NCBI網站的ORF finder和BLAST工具完成。利用DNAMAN軟件推測CsWRKY3基因編碼的氨基酸序列。目的基因編碼蛋白的等電點和分子量預測運用DNAStar軟件進行。利用DNAMAN軟件進行不同物種WRKY蛋白序列比對。使用MEGA5軟件構建系統發育樹。利用在線軟件SWISS-MODEL進行蛋白質三維結構預測。

1.6 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）

對反轉錄得到的cDNA進行實時熒光定量PCR（qRT-PCR）。選用SuperReal PreMix Plus （SYBR Green）作為熒光標記染料，以茶樹GAPDH（GAPDHF： 5′ATACCACGTCACCTCGGT3′；GAPDHR：5′ACTTATGATGAAATCAAAGCTGC3′）為內部參照基因，以CsWRKY3qrtF： 5′CCCTTCACCTTGGAGATGTT3′； WRKY3qrtR：5′AGAGCTCCCAAATCCTGAGA3′為CsWRKY3實時熒光定量引物。反應總體系為20 μL：SYBR Green SuperReal PreMix Plus 10 μL、上下游引物各1 μL、cDNA 1 μL、ddH2O 7 μL。qRT-PCR反應程序：95℃預變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火30 s，40個循環。每個樣品設置5個生物學重復。

1.7 數據分析

試驗數據通過PASW Statistics 18（Statistica，SAS，Institute，lnc.，Cary，NC，USA）軟件進行差異性分析。CsWRKY3在不同組織、不同葉位中的表達水平使用單因素方差分析法（ANOVA）進行比較，若差異顯著（P<0.05），則使用Duncans法進一步分析。茶尺蠖幼蟲取食、機械損傷兩種不同處理下CsWRKY3轉錄因子基因的表達水平使用獨立樣本T-test進行比較。

2 結果與分析

2.1 茶樹CsWRKY3基因的克隆endprint

以茶尺蠖取食的茶樹葉片為材料提取總RNA并反轉錄獲取cDNA。經PCR 擴增，獲得了大小約為2 000 bp 的特異性條帶（圖1），將克隆到的片段切膠回收連接克隆載體后測序，得到1 958 bp 的序列，與轉錄組數據的cDNA序列完全匹配。經ORF finder軟件預測，CsWRKY3基因的開放閱讀框（ORF）全長1 710 bp，編碼含有569個氨基酸殘基的蛋白質（圖2）。預測該蛋白的分子量為62.98 kD，等電點為7.70。使用在線軟件SWISS-MODEL對蛋白三維結構進行預測（圖3），該蛋白結構與番茄（Solanum habrochaites）中的ShWRKY4蛋白結構極其相似[21]。

2.2 茶樹CsWRKY3氨基酸序列比對

在NCBI中對CsWRKY3進行BLAST比對后，選取相似度高的10種植物的WRKY基因的氨基酸序列進行比對。結果顯示，CsWRKY3與胡蘿卜（Daucus carota，XM_017374603.1）、克萊門柚（Citrus clementina，XM_006431899.1）、陸地棉（Gossypium hirsutum，XM_016867635.1）、落花生（Arachis ipaensis，XM_016311067.1）、亞洲棉（Gossypium arboreum，XM_017783051.1）、葡萄（Vitis thunbergii，AM886166.1）、煙草（Nicotiana tabacum，AB022693.1）、大豆（Glycine max，NM_001317594.1）的WRKY蛋白均含有2個典型WRKY結構域和1個C2H2型鋅指結構，屬于WRKY家族中的第Ⅰ類；楊樹（Populus trichocarpa， KR025520.1）、芝麻（Sesamum indicum，XM_011084080.2）的WRKY蛋白均含有1個典型WRKY結構域和1個C2H2型鋅指結構，屬于WRKY家族中的第Ⅱ類（圖4）。

2.3 茶樹CsWRKY3系統發育分析

選用MEGA5軟件中鄰接樹算法對篩選出的與CsWRKY3序列相似度較高的10個不同物種的WRKY蛋白序列繪制系統發育樹。結果顯示，CsWRKY3與雙子葉植物綱中的胡蘿卜DcWRKY33、大豆GmWRKY25、落花生AiWRKY33進化關系較接近，與DcWRKY33的序列相似度達66.39%（圖5）。

2.4 CsWRKY3在茶樹不同組織、不同葉位中的表達分析

qRT-PCR數據分析顯示，CsWRKY3在茶樹根、莖、葉、花、種子等組織器官中均有表達，且在不同的組織器官中表達水平存在一定的差異（圖6）。如圖所示，茶樹CsWRKY3基因在根中表達量最高，與莖、葉、花、種子之間存在顯著性差異；CsWRKY3基因在葉、花中的表達量無顯著差異，在莖、種子中的表達量也無顯著差異，但在莖和種子中的表達量遠低于在根、葉、花中的表達量。

如圖7所示，CsWRKY3基因在不同葉位中的表達量存在明顯差異，在發育相對成熟的第四葉位的表達量最高，且與第一、二、三葉位存在顯著差異；CsWRKY3基因在第一、二、三葉位中的表達量沒有顯著差異。

2.5 機械損傷處理后CsWRKY3的表達分析

機械損傷處理茶樹葉片不同時間后，CsWRKY3基因的相對表達水平在損傷0.5 h后迅速達到表達高峰，且與對照組存在極顯著差異，這種顯著性差異一直持續到葉片受損4 h；在0.5、1、2、4 h這四個時間點，CsWRKY3基因的相對表達水平分別是對照組的75.2、17.8、8.1、4.3倍；損傷48 h后，CsWRKY3基因的表達水平與對照無顯著差異（圖8）。

2.6 茶尺蠖取食后CsWRKY3的表達分析

qRT-PCR數據分析表明，茶尺蠖幼蟲取食茶苗第二葉位1.5 h后，CsWRKY3被迅速誘導且差異極顯著，表達水平是對照茶苗的11.9倍；TG取食3、12、24 h后茶樹CsWRKY3基因的表達水平均有明顯的上調，分別是對照的4.9、2.7、3.6倍；CsWRKY3基因的誘導呈現驟升緩降再升再降的趨勢，于取食48 h后與對照沒有顯著差異（圖9）。

3 討論與結論

WRKY轉錄因子家族普遍存在于植物體內，對植物的多種生理過程有廣泛的調控作用，在眾多植物轉錄因子家族中占有重要地位[22]。自1994年Ishiguro等在研究中首次發現WRKY轉錄因子的存在起，研究者分別對擬南芥[23]、番茄[24]、水稻[25]等多種植物中的WRKY轉錄因子做了深入研究。

本研究根據茶樹轉錄組數據，通過RT-PCR技術獲得一個茶樹WRKY轉錄因子基因并命名為CsWRKY3，該基因ORF區域包含1 710個堿基，編碼569個氨基酸，與其他植物WRKY基因具有較高相似性。氨基酸序列分析表明該基因編碼蛋白含有2個特征性WRKY結構域和1個C2H2鋅指結構，根據Eulgem等對WRKY的分類[2]，屬于第Ⅰ類WRKY轉錄因子。

前人研究顯示，WRKY基因的表達具有組織特異性，例如：LCWRKY5基因僅在山羊草的根和葉中有表達[26]，AtWRKY25主要表達于擬南芥的根中[27]。本研究結果顯示，茶樹CsWRKY3轉錄因子基因在茶樹根、葉中相對表達量較高，在莖、種子中相對表達量較低，這與報道的馬鈴薯中StWRKY2基因在根和葉中的相對表達量顯著高于其它組織相一致[28]，表明CsWRKY3的表達也具有組織特異性。依據文獻研究規律，我們推測CsWRKY3在茶樹葉片中的相對表達水平之所以較高，可能與茶樹的防御反應有關[29]。WRKY基因具有誘導表達性，常見的是受到機械損傷的誘導，有報道顯示罌粟植株在受到機械損傷后體內PsWRKY基因迅速被誘導[30]，煙草WRKY基因會在葉片受到機械損傷的情況下過量表達[31]，基于此，我們以機械損傷和茶尺蠖取食茶樹葉片來驗證該基因的功能。endprint

Erb等[32]研究發現，植食性昆蟲取食植物葉片會對葉面造成機械損傷，從而引起植物的抗性反應。本試驗中，茶樹葉片經過機械損傷處理和茶尺蠖幼蟲取食處理后CsWRKY3被迅速激活，表達水平高于對照且差異顯著，并且持續表達時間較長。Skibbe等[33]的研究結果顯示，煙草受到煙草天蛾幼蟲取食時，NaWRKY3和NaWRKY6會激發茉莉酸途徑提高煙草的抗蟲性，據此我們推測CsWRKY3可能通過茉莉酸途徑參與茶樹對茶尺蠖的防御作用。李冉[34]的研究表明，二化螟為害水稻后OsWRKY24和OsWRKY70轉錄因子可以直接調控JA合成途徑的關鍵酶基因，或者通過調節其他轉錄因子間接調控JA合成酶基因。胡凌飛[16]的研究表明，二化螟和褐飛虱取食水稻時，OsWRKY53、OsWRKY70可以通過調控JA、ET和SA途徑來抵抗蟲害。這為我們下一步深入研究CsWRKY3參與的茶樹抗蟲作用機制提供了思路。

本試驗首次在茶樹中克隆到了CsWRKY3基因，并研究了該基因在不同組織器官中的表達差異性；通過分析該基因在機械損傷和茶尺蠖幼蟲取食下的表達情況，推測CsWRKY3基因參與了茶樹抵抗植食性昆蟲為害的防御反應，這為后期研究CsWRKY3參與茶樹抗蟲反應的作用機制提供了研究基礎。

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