基于EST—SSR標記的云南大葉茶資源遺傳多樣性分析

尚衛瓊+段志芬+楊毅堅+李友勇+成浩+劉杰+楊興榮+楊盛美+矣兵+劉本英+畢曉清

摘要：豐富的遺傳變異對提高作物的環境適應性和加快遺傳改良進度至關重要。為進一步了解云南大葉茶種質資源的遺傳多樣性，利用28對SSR引物對94份大葉茶種質材料進行遺傳多樣性分析，結果共檢測到等位基因128個，平均每個位點為4.57個；Shannon信息指數（I）在0.91～1.66之間，最小為5087位點0.91，最大為1696位點1.66，平均每個位點為1.30；多態性信息含量（PIC）數值在0.476～0.753之間，最小為5087位點0.476，最大為1696位點0.753，平均值為0.64；平均觀測雜合度和平均期望雜合度分別為0.71、0.70。通過對94份供試材料來源地遺傳分化分析和聚類分析表明，材料的遺傳變異主要存在于不同來源地之間而非同一來源地內。并且多數同一來源的材料分散在不同類群中，材料來源地間遺傳距離與地理距離不存在顯著的相關性。研究認為，聚類結果與多態性信息含量等參數值分析結果一致，表現出豐富的遺傳多樣性。這可為云南茶樹資源的育種和創新利用提供研究基礎。

關鍵詞：云南；大葉茶 ； EST-SSR；分子標記

中圖分類號：S571.1文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2018）01-0016-07

Abstract Abundant genetic variation is very important for improving environmental adaptability and genetic improvement of crop. In order to know the genetic diversity of Daye tea germplasm resources in Yunnan， 94 tea germplasms were selected for the analysis using 28 pairs of SSR primers.A total of 128 distinctive loci were detected with the mean as 4.57； the Shannons information index （I） ranged from 0.91 to 1.66 with the mean as 1.30， and 0.91 and 1.66 were in the loci 5087 and 1969 respectively； the polymorphism information content （PIC） ranged from 0.476 to 0.753 with the mean as 0.64，and 0.476 and 0.753 were also in the loci 5087 and 1696 respectively； the average observed heterozygosity and the average expected heterozygosity were 0.71 and 0.70 respectively. The results of genetic differentiation analysis and cluster analysis for the source areas of 94 tea germplasms showed that genetic variation mainly existed between the germplasms from different source areas but not from the same source area， and most germplasms from the same source area distributed in different groups；there was no significant correlation between the genetic distance and the geographical distance. It was concluded that the cluster analysis and the analysis of PIC had the same results， which showed abundant genetic diversity. These results could provide research foundations for breeding， innovation and utilization of Yunnan tea germplasms.

Keywords Yunnan； Daye tea； EST-SSR； Molecular marker

茶樹種質資源是茶樹育種、遺傳研究和生產利用的物質基礎。云南具有十分豐富和多樣化的生物種質資源，還是世界茶樹起源中心和茶樹多樣性分布中心[1]，其茶樹種質資源共涉及茶組植物35個種3個變種（其中26個種為云南獨有），種類和類型約占世界茶樹種類的74.5%。目前，共保存有山茶科山茶屬茶組植物28個種3個變種共計2 157份茶樹種質資源，它們具有明顯的地域特色，多以云南特有的大葉茶資源為主，也包括一些中小葉種、小葉種、野生資源和特有地方品種資源。

種質資源的科學鑒定和評價是優異資源發掘和利用的前提。分子標記作為以生物體的遺傳物質DNA的多態性為基礎的遺傳標記在茶樹資源遺傳多樣性分析中被廣泛運用[2]，主要包括RFLP、RAPD、AFLP、SSR、SCAR、ISSR等技術。EST-SSR技術是在SSR標記基礎上發展起來的一種新的標記技術，除了具有SSR標記[3-5]的特點外，還有成本低、通用性好、條帶清晰、帶形容易統計等優點[6]。在茶樹遺傳多樣性、指紋圖譜、分子鑒別等研究上得到很好應用，證明是一種非常有效、可靠的分子技術[7]。云南作為大葉茶種質資源最豐富的地區，可為分析茶樹的遺傳多樣性和茶樹育種提供物質基礎和廣闊的利用空間，其中一些特殊的茶樹資源是學術研究的重要課題。周萌等[8]對云南地區100份野生和22份茶樹品系進行遺傳多樣性分析，結果表明云南野生茶樹品系具有豐富的遺傳多樣性；劉本英等[9]對云南的134份茶樹資源進行遺傳多樣性和親緣關系分析，結果各茶組間也表現出豐富的遺傳多樣性，這都可為云南茶樹育種提供一定的理論基礎。但是就目前而言，利用DNA分子標記在云南茶樹種質資源上的研究報道尚為數不多，對優異資源的篩選還主要單純依賴茶樹生化成分分析，這對茶樹育種起到嚴重的滯后作用。本試驗通過選擇包括云南不同地區94份大葉茶種質資源為材料，利用28對SSR引物對其進行遺傳多樣性和親緣關系分析，以期進一步了解云南大葉茶各地區的種質資源信息，為后期的優良種質資源收集、保護和利用提供科學依據。endprint

1 材料與方法

1.1 材料

在“國家種質勐海茶樹分圃”內選擇具有代表性的大葉茶資源材料94份，采其新梢一芽二葉4～5枝，放置于預先標號且裝有干燥硅膠的自封袋中，-80℃冰箱保存備用。供試材料的基本信息見表1。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 將各份供試材料分別進行打樣磨碎，采用改良的CTAB法[10]提取基因組DNA。利用0.8%瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop 2000分光光度計測定DNA的純度和濃度，稀釋至20 ng/μL，-20℃保存備用。

1.2.2 SSR引物及PCR擴增 28對SSR引物用于樣品材料的擴增，其序列參照文獻[11]～[14]。所有引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。PCR擴增反應在PTC-200型PCR儀上進行，反應體系為10 μL，包括上下游引物各0.2 μL，10×Buffer（Mg2+）1 μL，dNTP 0.2 μL，Taq酶0.5 U，加ddH2O至10 μL。PCR反應程序為：94℃ 3 min；94℃ 30 s，退火30 s，72℃ 30 s，30個循環；72℃ 10 min，4℃保存。PCR產物用10%聚丙烯酰胺凝膠在電泳儀上進行電泳檢測，電壓170 V，時間120 min。銀染顯色，使用凝膠成像儀拍照記錄。

1.2.3 數據處理 電泳圖上的條帶處理參照張成才等[15]的方法，將電泳圖上的條帶由大到小按照A、B、C、D、E等依次賦值，缺失條帶以“-”表示，統計樣品材料的基因型。使用Popgene Ver.1.32軟件計算每對引物的觀測等位基因數（Na）、觀測雜合度（Ho）、期望雜合度（He）、Shannon 信息指數（I）和Fit、Fis、Fst等數值。其中，Fit指計算出的基因型的實際頻率與理論期望頻率在所在群體中的偏離程度，Fis指基因型的實際頻率與理論期望頻率在亞群體（居群間或物種間）中的偏離程度，Fst表示亞群體之間的遺傳分化程度。根據公式Nm=0.25×（1-Fst）/Fst計算放映基因流強度（Nm）。通過PIC-CALC0.6計算各位點的多態性信息含量（PIC，polymorphism information content），分子系統樹狀圖采用非加權配對平均算術法（UPGMA）聚類分析構建，分析其遺傳多樣性和親緣關系。

2 結果與分析

2.1 不同來源大葉茶資源材料的遺傳多樣性分析

運用28對SSR引物對94份云南地區大葉茶資源的遺傳多樣性進行分析，測定其等位基因數、Shannon信息指數、觀測雜合度、期望雜合度和多態性信息含量數值。圖1為28對引物中編號5122擴增產物的聚丙烯酰胺電泳圖。28對引物在94份個體中的遺傳多樣性分析結果見表2。共檢測出128個觀測等位基因，每個位點擴增出的等位基因數在3～6個之間，平均每個位點為4.57個。Shannon信息指數（I）在0.91～1.66之間，最小為5087位點0.91，最大為1696位點1.66，平均每個位點為1.30，除5087位點Shannon信息指數小于1以外，其它位點值都大于1。觀測雜合度（Ho）數值在0.41～0.98之間，最小為1696位點0.41，最大為5115位點0.98，平均值為0.71。期望雜合度（He）數值在0.53～0.78之間，最小為5087位點0.53，最大為1696位點0.78，平均值為0.70。多態性信息含量（PIC）數值在0.476～0.753之間，最小為5087位點0.476，最大為1696位點0.753，平均值為0.643。期望雜合度（He）作為度量群體遺傳多樣性水平的重要參數，在28個位點中，平均觀測雜合度值略大于期望雜合度。12個位點（4119、5061、5129、1696、1926、5017、2049、5123、1051、5073、1651、E-140）的觀測雜合度數值低于期望雜合度數值。3個位點（1916、5129、1696）的等位基因數為6個，說明在群體遺傳結構中有較高的重要性，而5087位點的等位基因數為3個，具有較低的遺傳重要性。多態性信息含量（PIC）是一個衡量位點多態性的重要指標，除位點5087（0.476）的數值在0.25～0.50之間以外，其它27個位點的數值都大于0.50，說明位點5087表現為中度遺傳多態性，而其它27個位點表現為高度遺傳多態性，表明94份云南地區大葉茶資源材料具有豐富的遺傳多態性，都可作為茶樹遺傳育種的重要材料。

2.2 不同來源大葉茶材料遺傳分化分析

對94份材料的不同來源地間遺傳分化進行分析，結果（表3）表明，統一來源地內基因多樣性（Fis）平均值為-1.0000，并且全部引物都為-1.0000，都表現為雜合體偏高；不同來源地間基因多樣性（Fit）平均值為0.6261，表明供試茶樹資源總體雜合子不足。不同來源地間遺傳分化系數（Fst）為0.8130，表明81.3%的遺傳分化系數存在于材料不同來源地間。材料不同來源地間基因流（Nm）平均值為0.0575，基因流較大，說明不同來源地間基因交流程度很高。因此，本試驗中供試材料的遺傳變異主要存在于不同來源地之間而非同一來源地內。

2.3 不同來源大葉茶材料聚類圖與遺傳多樣性分析

94份供試材料基于Neis遺傳距離構建的UPGMA聚類圖如圖2所示。在大類群中，可將94份材料分為4大類，高良野茶（22）和黃泥河野茶（27）為一個大類。安康大葉茶（1）、大卵圓大葉茶（93）、文家塘大葉茶（94）、溫泉原頭茶（68）、下街大葉茶（91）、景新小黃茶（92）、小廠大葉茶（71）、羊岔街野茶（75）、元江磨房茶（78）、腰街大葉茶（76）、育樂野茶（77）、元江軟茶（80）、鎮沅大葉（82）、者竜峨大葉（81）、孟連大葉茶（85）、三中大葉茶（84）、幫崴坎子茶（86）和大曼呂大葉茶（87）共18份材料聚為一個大類。其它材料則分散分布于聚類圖中，形成兩個大類。各兩份供試材料均具有較大的遺傳距離和較低的遺傳相似度，下街大葉茶（91）和景新小黃茶（92）遺傳距離最小為0.3391，相似度0.7124；其次是蚌崗大葉茶（8）和德思里茶（17）的遺傳距離為0.3700，相似度0.6908；幫崴壩子茶（86）和大曼呂大葉茶（87）的遺傳距離為0.3808，相似度0.6833。從整個遺傳聚類圖來看，結果與多態性信息含量等參數值分析結果一致，表現出豐富的遺傳多樣性。endprint

3 討論與結論

云南茶樹種質資源極為豐富，一些珍稀資源具有重要的研究價值和利用潛力。多態性信息含量（PIC）值作為衡量資源遺傳多樣性的重要指標，PIC<0.25時位點表現為低度多態性，0.250.5時為高度多態性。本研究通過利用28對SSR引物對云南不同地區94份大葉茶資源進行遺傳多樣性分析，多態性信息含量（PIC）值在0.476～0.753之間，平均值為0.643。PIC>0.5的有27對，占96.4%，27對引物表現高度多態性，說明94份供試茶樹資源具有豐富的遺傳多樣性。這與劉本英等[11]分析云南地區其它材料的結果一致。本研究通過選擇之前尚未進行過遺傳多樣性分析的種質材料進行分析，并且分析結果明顯高于其它地區的相關研究結果。另外，從觀測等位基因數、Shannon 指數和多態性信息含量分析，所選的28對引物中較好的引物有2049、5115。但所選的引物都不是最有效的引物，還不能充分表現茶樹資源供試材料的多態性。等位基因數變幅不大，而Shannon信息指數變幅在0.91～1.66之間，等位基因數與Shannon信息指數在一定程度上變化趨勢大體一致，但是Shannon信息指數能更好地反映群體的遺傳多樣性程度，可作為更好的評判參照標準。

通過聚類分析發現，94份供試材料可分為4個大類，多個亞群。各兩份供試茶樹資源間具有較大的遺傳距離和較低的遺傳相似度，遺傳距離最小的下街大葉茶（91）和景新小黃茶為（92）0.3391，相似度0.7124。整個聚類除個別按照地域特點或者種質學聚集外，大部分材料都顯示無規律聚集。圖中按照地域特點聚集較明顯的分別有勐海縣布朗山的28號（吉良大葉）和29號（吉良綠梗綠芽茶）、新平的73號（新平茶）和74號（新平峨毛茶）、鳳慶的45號（馬街野生茶）和32號（津秀大葉）、景谷的72號（小景谷大葉）和33號（景谷紅芽直立茶）分別單獨聚在一個小類，且與其它材料距離較遠，說明它們有可能有相同的遺傳基因，可作為育種工作的重要研究材料。按照種質學聚集較明顯的來自麻栗坡的兩份汝城毛葉茶茶樹資源（麻栗坡白毛茶、壩子白毛茶）卻分散在不同的類群，遺傳距離較遠。整個遺傳圖譜表現出豐富的遺傳多樣性，可能與不同地區不同種質學等因素有極大關系，并且分析結果與季鵬章等[16-21]的研究結果一致。

云南作為茶樹的原產地，種質資源豐富，遺傳背景復雜，但對其的SSR標記工作進行緩慢，未能建立起相關的茶樹基因組SSR標記體系。這對構建茶樹資源核心種質庫、分子指紋圖譜等研究有一定的影響。對此，今后應結合云南優質、高抗、功能性茶樹品種篩選這個育種目標，加快云南茶樹資源的DNA分子技術研究，使其成為當前的一個重要課題，這對云南乃至全國大葉茶優異種質資源的發掘、創新及運用和加快育種目標實現的步伐有重要作用。

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