四氫嘧啶對凝乳酶熱穩定性的影響

武彬+石天虹+劉雪蘭+閻佩佩+井慶川

摘要：為研究四氫嘧啶對凝乳酶熱穩定性的影響，向凝乳酶溶液中加入0.175～5.600 mmol/L的四氫嘧啶，測定不同濃度四氫嘧啶對凝乳酶活力的影響；之后測定了含0.50～2.00 mmol/L四氫嘧啶的凝乳酶溶液在69℃保溫不同時間后的凝乳酶活力，將熱保溫后的酶溶液在4℃復性36 h，并再次測定酶活力的變化。結果顯示，不同濃度四氫嘧啶對凝乳酶活力影響不大，各組酶活力均降低8.2%左右；加入四氫嘧啶會顯著降低凝乳酶的熱穩定性，但會發生明顯的復性作用，提示四氫嘧啶可能具有維持部分失活態凝乳酶穩定性的作用。

關鍵詞：四氫嘧啶；凝乳酶；熱穩定性；復性作用

中圖分類號：S879.1文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2018）01-0131-04

Abstract To study the effect of ectoine on the thermostability of rennin， 0.175～5.600 mmol/L ectoine were added into rennin solution to determine the effects of ectoine concentration on rennin activity， and then the rennin solutions added 0.50～2.00 mmol/L ectoine were heated in water bath at 69℃ for different time， and renaturated at 4℃ for 36 hours. The changes of rennin activities after water-bath and renaturation were both determined. The results showed that different concentrations of ectoine had little effects on rennin activity， and the rennin activity decreased by about 8.2%.When ectoine was added into rennin solution， the thermostability of rennin decreased and renaturation would significantly happened， which indicated that ectoine might be essential for keeping the stability of partial inactivated rennin.

Keywords Ectoine； Rennin； Thermostability； Renaturation

凝乳酶是制作乳酪和干酪素必需的酶制劑，能水解牛奶中κ-酪蛋白的Phe105-Met106肽鍵，使牛奶凝結，經過一系列加工過程后制成乳酪[1]。醫學研究結果表明，凝乳酶還具有治療兒童消化不良的臨床作用[2]。凝乳酶與其他酶制劑一樣，在生產和應用中，高熱、凍融、輻射、有機溶劑等都可能使酶變性失活，導致酶活力損失。乳酪加工對凝乳酶的添加量有嚴格的要求[3]，而作為藥品制劑也要求凝乳酶能夠保持較高的穩定性。固定化、化學修飾和蛋白質工程等方法都能夠提高酶制劑的熱穩定性，而添加糖類、多元醇、聚合物等穩定劑的方法適用范圍廣，作用效果較好，得到了廣泛應用。

Ectoine（1，4，5，6-四氫-2-甲基-4-嘧啶羧酸，簡稱四氫嘧啶）是Galinski等[4]發現的在耐鹽微生物中所廣泛含有的一種滲透壓補償性溶質，具有穩定天然蛋白質水化層，保護酶和DNA等生物大分子和細胞膜結構，提高其穩定性等作用。四氫嘧啶能夠提高中性蛋白酶、脂肪酶、超氧化物歧化酶、糖化酶、植酸酶等酶制劑的熱穩定性，其最佳使用濃度相差很大。魏勝華等發現提高中性蛋白酶熱穩定性的四氫嘧啶最佳添加濃度為5.0 mmol/L，可使該酶殘余活力提高51.8%[5]；王越等研究表明，四氫嘧啶提高脂肪酶熱穩定性的最佳濃度為1.5 mmol/L[6]。李強等報道對于超氧化物歧化酶，四氫嘧啶濃度在0.1～0.7 mmol/L對其熱穩定性的作用效果最佳[7]。酶的熱失活是溫度和時間復合作用的結果，但大部分研究在測定酶的熱穩定性時，多選取固定保溫時間，沒有跟蹤酶活力隨保溫時間變化的情況。

目前，關于穩定劑對酶的保護機理多是在海藻糖的研究結果上提出的玻璃態假說、水替代假說和優先排阻假說[8]，關于四氫嘧啶對酶的保護機理研究不多。本試驗主要研究了四氫嘧啶對凝乳酶熱穩定性的影響，研究結果有助于增強四氫嘧啶提高酶制劑穩定性作用機理的理解。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

四氫嘧啶購自Sigma公司，純度>98%；凝乳酶購自Sigma公司；脫脂奶粉購自伊利實業有限公司；其他試劑均為分析純；水為二次去離子水。

1.2 試驗方法

1.2.1 凝乳酶活力測定與相對酶活力計算 凝乳酶活力測定采用Arima法[9]：凝乳酶以0.02 mol/L pH 6.0的磷酸緩沖液稀釋800倍，以此為原液，取0.5 mL，在35℃預熱5 min，加入到5 mL 35℃預熱的pH 6.0、含1% CaCl2的10%脫脂牛乳中，計時至管壁出現顆粒，記錄凝乳時間（T）。以35℃ 40 min凝乳1 mL牛乳的酶量為一個酶活力單位（U）。凝乳酶活力及相對活力的計算公式如下：

凝乳酶活力A=5×24000.5×T×n ； （1）

凝乳酶相對活力Ar=ApA0×100% 。 （2）

式中，T為凝乳時間，s；n為稀釋倍數，本試驗為1；Ap為經過各種處理后凝乳酶的殘余活力，U；A0為未經任何處理的凝乳酶活力，U。endprint

1.2.2 四氫嘧啶對凝乳酶活力影響的測定 取凝乳酶原液與分別含有0.175、0.350、0.525、0.700、1.050、1.400、2.800、4.200和5.600 mmol/L四氫嘧啶的混合酶液，測定其酶活力，并計算凝乳酶相對活力。

1.2.3 熱失活處理 1.5 mL離心管中加入1.2 mL含有0、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50和2.00 mmol/L四氫嘧啶的凝乳酶溶液，放入69℃水浴并立即開始計時，每分鐘取樣一次，樣品取出后立即轉入冰水中快速降溫，然后取0.5 mL酶液測定殘余凝乳酶活力。

1.2.4 復性處理 將1.2.3中經過熱失活處理并降溫的不含四氫嘧啶與含有0.75 mmol/L四氫嘧啶的凝乳酶液轉入冰箱4℃靜置36 h后取出，取0.5 mL測定凝乳酶活力，計算相對酶活力，并與1.2.3中結果進行比對。

2 結果與分析

2.1 四氫嘧啶對凝乳酶活力的影響

凝乳酶通過水解κ-酪蛋白生成副κ-酪蛋白，繼而發生蛋白質膠體聚集并形成化學鍵而使牛奶凝結。四氫嘧啶是一種滲透壓補償性溶質，能夠與凝乳酶分子表面和內部的基團結合，引起凝乳酶分子氫鍵和其他分子間作用力的改變，這可能會影響凝乳酶催化活力的正常發揮。由圖1看出，加入的四氫嘧啶濃度在0.175～5.600 mmol/L范圍內，凝乳酶活力均降低8.2%左右。

2.2 四氫嘧啶對凝乳酶熱穩定性的影響

在加入四氫嘧啶后，凝乳酶的熱穩定性都有不同程度地降低，四氫嘧啶為0.75 mmol/L時，能測到酶活力的熱處理時間最長，處理7 min相對活力仍保留9%且其相對酶活力也明顯高于其他濃度組；其他濃度保溫4～6 min后，即無法測到酶活力（凝乳時間>600 s，酶活力損失>93.3%）；當四氫嘧啶濃度大于2.00 mmol/L時，即使保溫時間為1 min的樣品也無法測到凝乳酶活力（圖2）。

2.3 四氫嘧啶對凝乳酶復性的作用

試驗結果表明，不含四氫嘧啶凝乳酶的對照組，在復性前后酶活力基本保持不變；而含有四氫嘧啶的凝乳酶復性作用十分顯著。熱處理時間3 min以上時，復性效果較為顯著，復性導致的相對酶活力提升保持在10%～15%；熱處理5 min以上，復性后的含四氫嘧啶的凝乳酶相對酶活力高于不含四氫嘧啶的對照組（圖3）。

3 討論與結論

魏勝華等認為四氫嘧啶能夠改變酶分子的氫鍵締合，增加β-折疊結構，維持酶分子構象從而提高酶制劑的熱穩定性[5]。然而，四氫嘧啶添加量顯著影響到其對酶的保護作用，過量的四氫嘧啶會抑制酶活力[6]。Meyer等發現四氫嘧啶增強了DNA分子從雙螺旋結構向開環結構的變化[10]，其原因可能是由于大分子所帶電荷對四氫嘧啶的影響。本研究結果表明，加入0.175～5.600 mmol/L四氫嘧啶后，凝乳酶活力均降低8.2%左右，該結果與王越報道的四氫嘧啶提高植酸酶熱穩定性的結果截然不同[11]，這可能與凝乳酶和植酸酶分子結構的差別有關。

目前，二步串聯失活動力學模型能夠很好地分析和解釋某些酶的失活過程[12]，模型如下：

ENKEDKiEi 。 （3）

式中，EN為活性態酶；ED為部分失活態酶；Ei為完全失活態酶；K為可逆失活步驟中的平衡常數；Ki為不可逆失活步驟的失活速率常數。酶的熱失活過程的發生分為兩步，首先活性態的酶EN先可逆失活為部分失活態酶ED，然后部分失活態酶ED不可逆失活為完全失活態酶Ei。

本研究結果顯示，加入0.50～2.00 mmol/L的四氫嘧啶，都會使凝乳酶的熱穩定性顯著降低，其中，四氫嘧啶濃度為0.75 mmol/L時，酶活力降低的最慢。另外，處于部分失活狀態的凝乳酶在經過36 h復性處理后，酶活力又有一定的回升，熱處理3～7 min復性作用最為顯著，相對酶活力提升了10%～15%。該結果可能提示四氫嘧啶具有誘導凝乳酶結構向部分失活態轉變并維持該狀態保持相對穩定的作用。

參 考 文 獻：

[1] Johnson M， Law B A. The origins， development and basic operations of cheesemaking technology[M]. West Sussex： Blackwell Publishing Ltd.2010：68-98.

[2] 李剛. 復合凝乳酶治療兒童功能性消化不良的臨床觀察[J]. 臨床醫學研究與實踐， 2017， 2（2）： 75-76.

[3] 熱娜古麗·木沙， 古麗娜孜·托合塔日巴依， 葉斯曼，等. 牛奶軟質干酪的凝乳工藝研究[J]. 中國乳品工業， 2017， 45（6）：55-56，60.

[4] Galinski E A， Pfeiffer H P， Trüper H G. 1，4，5，6-tetrahydro-2-methyl-4-pyrimidinecarboxylic acid. A novel cyclic amino acid from halophilic phototrophic bacteria of the genus Ectothiorhodospira[J]. Eur. J. Biochem.， 1985， 149（1）：135-139.

[5] 魏勝華， 趙永利，余俊，等.四氫嘧啶提高中性蛋白酶熱穩定性的研究[J]. 安徽農業科學， 2009，37（22）：10345-10346.

[6] 王越， 張苓花. 四氫嘧啶提高脂肪酶催化合成油酸乙酯產率的研究[J]. 食品工業科技， 2010， 31（11）：224-227.

[7] 李強， 王越， 王運吉， 等. Ectoine對Cu-Zn型SOD酶熱穩定性的影響[J]. 大連輕工業學院學報， 2007， 26 （2）：116-119.

[8] 葛宇，袁勤生. 海藻糖對生物活性物質的保護作用機理研究進展[J]. 藥物生物技術， 2002， 9（5）：297-300.

[9] Arima K. Milk clotting enzyme from microorganism. Part Ⅰ. Screening test and the identification of the potent fungus[J].Agric.Biol.Chem.，1967， 31（5）：540-545.

[10]Meyer S， Schroter M A， Hahn M B， et al. Ectoine can enhance structural changes in DNA in vitro [J]. Scientific Reports， 2017， 7 （1）：71-70.

[11]王越. 滲透壓補償性溶質Ectoine對酶穩定性影響的研究[D]. 大連：大連海事大學， 2011.

[12]尹春華， 譚天偉， 劉江帆. 不同體系下根霉脂肪酶失活動力學模型研究[J]. 分子催化， 2009， 23（1）： 78-82.endprint