長期施肥和灌溉對土壤細菌數量、多樣性和群落結構的影響

楊亞東，王志敏，曾昭海

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長期施肥和灌溉對土壤細菌數量、多樣性和群落結構的影響

楊亞東，王志敏，曾昭海

（中國農業大學農學院， 北京 100193）

【目的】通過對華北地區一年兩熟種植模式下冬小麥生長季不同施肥和灌溉處理下土壤細菌群落的研究，揭示長期不同施肥和灌溉制度下土壤細菌數量、多樣性和群落結構的變化規律。為科學施肥和灌溉，提高農田地力和維持土壤微生物多樣性等提供依據。【方法】依托中國農業大學吳橋實驗站，選取長期施肥和灌溉定位試驗的6個處理冬小麥收獲后耕層土壤為研究對象，分別為化肥+不灌溉（CI0）、化肥+拔節期灌溉（CI1）、化肥+拔節期灌溉+灌漿期灌溉（CI2）、有機肥+不灌溉（MI0）、有機肥+拔節期灌溉（MI1）和有機肥+拔節期灌溉+灌漿期灌溉（MI2）。借助熒光定量PCR技術和Illumina Miseq高通量測序平臺，以16S rRNA基因為標靶，研究長期不同施肥和灌溉制度對土壤細菌數量、多樣性和群落結構的影響，并分析細菌數量、多樣性和群落結構變化與土壤理化性質的相關性。【結果】灌溉顯著提高了土壤含水量和土壤pH，施有機肥比施化肥顯著提高了土壤有機碳含量。不同處理細菌16S rRNA基因拷貝數為每克干土4.34×109—1.39×1010。灌溉顯著提高了細菌數量，化肥和有機肥處理分別提高了1.17—1.60和0.76—1.93倍。多樣性指數結果表明灌溉顯著影響細菌群落多樣性指數，施肥對細菌群落多樣性指數的影響均不顯著。門水平上，18個樣品共獲得39個類群，其中變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、酸桿菌門（Acidobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes）為優勢類群，相對豐度共占77.22%—86.28%。不同處理間放線菌門（11.09%—27.01%）、擬桿菌門（5.45%—12.13%）和Saccharibacteria（2.41%—3.77%）的相對豐度差異顯著。灌溉顯著降低了放線菌門和Saccharibacteria的相對豐度，化肥和有機肥處理分別降低了36.48%—48.03%、22.17%—33.67%和15.21%—45.54%、13.40%—23.97%。層次聚類和主成分分析結果顯示施肥和灌溉對細菌群落結構都產生影響，相同灌溉次數處理的細菌群落結構相似，而相同施肥處理間細菌群落結構差異較大，表明灌溉對細菌群落結構的影響強于施肥。此外，土壤含水量、土壤pH、全氮含量和有機碳含量與細菌數量、多樣性指數和群落結構存在一定的顯著相關關系。【結論】灌溉顯著改變了細菌數量、多樣性和群落結構，施肥對細菌數量和群落結構的影響較小。土壤含水量和土壤pH是造成土壤細菌數量、多樣性和群落結構差異的主要原因。

有機肥；灌溉；細菌群落多樣性；高通量測序；華北地區

0 引言

【研究意義】土壤微生物是土壤肥力的重要組成部分，在維持土壤生態功能中扮演著重要角色[1]，同時也是評價土壤質量和生產力的重要指標[2]。施肥和灌溉是農業生產中最主要的農業管理措施，具有促進作物生長和提高產量的作用，同時也對土壤微生物產生影響。土壤微生物數量、群落結構和生物活性的變化直接或間接影響土壤肥力和可持續生產力[3]。華北地區是中國重要的糧食生產基地，以冬小麥-夏玉米種植模式為主。冬小麥生長季需要大量施肥和抽取地下水灌溉，導致地下水污染和地下水水位持續下降[4]，使該地區面臨嚴峻的水資源危機。研究不同施肥和灌溉處理土壤細菌數量、多樣性和群落結構的變化，揭示土壤微生物對施肥和灌溉的響應機制，為改進施肥和灌溉制度，提高土壤肥力和生產力，緩解地下水資源危機提供依據。因此，開展施肥結合灌溉對土壤細菌數量、多樣性和群落結構影響的研究具有重要意義。【前人研究進展】施肥改變了土壤微生物的數量、群落結構和活性，引起土壤生物肥力差異，進而影響土壤結構、肥力和可持續生產力[5]。長期施用化肥顯著提高了水稻土壤中細菌數量[6]，并改變了細菌群落結構和多樣性[6-7]。施用有機肥能顯著改變微生物的群落結構及多樣性[8-9]，提高微生物的生物量和代謝活性[10]。此外，土壤水分管理也對土壤微生物的數量、群落結構和活性產生影響[11]。土壤含水量通過影響土壤營養物質運輸、底物可用性和土壤其他特性，改變土壤微生物的群落組成和活性[12-13]。近年來，隨著測序技術的快速發展，新一代測序技術被廣泛應用到環境微生物群落的研究中。高通量測序技術具有測序深度深和獲得數據量大等優點，能更真實地揭示微生物群落的復雜性和多樣性，加快了環境中不可培養和痕量微生物的研究[14]。前人利用Roche 454和Illumina Miseq測序平臺探討了施肥和灌溉等農業管理措施對不同類型土壤中微生物群落多樣性和結構組成的影響[8, 15-17]，并取得了一定進展。【本研究切入點】由于冬小麥生長季長期施用化肥和抽取地下水灌溉，造成了華北地區土壤氮素淋溶、生產力降低和嚴峻的地下水資源危機[4,18]。施用有機肥能改善土壤質量、改變土壤微生物組成，提高土壤生產力[19]。同時，減少冬小麥生長季灌溉用水是緩解華北地區地下水超采壓力的重要措施。先前的研究多集中在施肥或灌溉等單一措施對土壤細菌群落的研究，缺乏施肥與灌溉結合管理對土壤細菌群落影響的系統研究。【擬解決的關鍵問題】本研究以中國農業大學吳橋實驗站長達11年的冬小麥-夏玉米種植模式定位試驗為平臺，以冬小麥收獲后耕層土壤為研究對象，以16S rRNA基因為標靶，借助熒光定量PCR技術和Illumina MiSeq高通量測序平臺，探討不同肥料類型和灌溉次數處理土壤細菌數量、多樣性和群落組成的變化及其與土壤理化性質的關系，為優化該地區農田施肥和灌溉制度，提高土壤肥力，維護土壤微生物生態系統和農業可持續發展等方面提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

試驗在中國農業大學吳橋實驗站范屯鄉姚莊村（北緯37°41'，東經106°37'）進行。試驗區位于滄州地區最南端，海河平原黑龍港流域中部，屬暖溫帶半濕潤大陸性季風氣候，全年光照2 724.8 h，年平均氣溫12.9 ℃，無霜期201 d，歷年平均年降水量562 mm，小麥季平均降雨量127.3 mm。土壤為沖積型鹽化潮土，壤質底黏。

施肥和灌溉長期定位試驗起始于2005年，設2種肥料類型和3個灌溉梯度，共6個處理。分別為：化肥+不灌溉（CI0）、化肥+拔節期灌溉（CI1）、化肥+拔節期灌溉+灌漿期灌溉（CI2）、有機肥+不灌溉（MI0）、有機肥+拔節期灌溉（MI1）和有機肥+拔節期灌溉+灌漿期灌溉（MI2）。小區面積為66.7 m2，3次重復。冬小麥播種前澆足底墑水，灌溉量為750 m3·hm-2，之后每次灌溉量均為750 m3·hm-2。冬小麥生長季氮、磷、鉀肥施用量分別為尿素150 kg·hm-2、磷酸二銨300 kg·hm-2和硫酸鉀225 kg·hm-2；有機肥為雞糞，施用量為22.5 m3·hm-2。所有肥料均作為基肥一次性施入。田間管理同常規大田生產。試驗開始前耕層（0—20 cm）土壤的基本理化性質：pH 7.43，有機碳11.10 g·kg-1，全氮1.05 g·kg-1，有效磷49.10 mg·kg-1，速效鉀123.75 mg·kg-1。

1.2 土壤樣品采集

于2016年6月，取冬小麥收獲后耕層（0—20 cm）土壤。每個小區隨機取5個樣點混合成1個樣品，用冰盒保存土樣，運輸至實驗室。將土壤樣品過2 mm篩，去除小麥根系殘體和雜物后分為兩部分。一部分凍存于-80℃冰箱中，用于土壤微生物分析。另一部分鮮土樣用于測定土壤銨態氮、硝態氮和含水量，余下部分自然風干后測定土壤pH、全氮和有機碳。

1.3 試驗方法

1.3.1 土壤理化性質測定 土壤含水量采用烘干法測定，土壤pH采用電位法測定（水土比=2.5﹕1），土壤全氮含量采用半微量凱氏定氮法測定，土壤總有機碳測定采用濃硫酸-重鉻酸鉀消煮-硫酸亞鐵滴定法[20]。土壤銨態氮和硝態氮用2 mol·L-1KCl溶液浸提鮮土樣后，采用流動分析儀測定（SAN++，Skalar，Holland）。

1.3.2 土壤微生物總DNA提取和PCR擴增 土壤總DNA使用美國OMEGA公司的E.Z.N.A.?Soil DNA Kit（Omega, GA, USA）試劑盒，每個樣品稱取約0.5 g新鮮土壤，按照試劑盒提取步驟進行。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測提取DNA的純度和完整性，用核酸定量儀（NanoDrop ND-1000）檢測提取DNA的濃度和純度。

用引物BACT1369F（5′-CGG TGA ATA CGT TCY CGG-3′）和PROK1541R（5′-AAG GAG GTG ATC CRG CCG CA-3′）[21]擴增細菌16S rRNA基因。PCR體系為：10×緩沖液 5.0 μL，dNPT（2.5 μmol·L-1）4.0 μL，上下游引物（10 μmol·L-1）各1.0 μL，DNA模板2.0 μL（1-10 ng），（5 U·μL-1）1.0 μL（TaKaRa，大連，中國），最后用超純水（ddH2O）補至50.0 μL。PCR擴增條件為：95℃ 3 min；94℃ 45 s，55℃ 30 s，72℃ 45 s，30個循環；72℃ 5 min。將PCR產物回收，連接至pMD18-T載體（TaKaRa，大連，中國），轉化至大腸桿菌DH5α感受態中，篩選陽性克隆測序，并提取含16S rRNA基因的質粒，用核酸定量儀（NanoDrop ND-1000）測定質粒濃度，計算16S rRNA基因拷貝數，按10倍梯度稀釋至每微升8.75×108—8.75×103拷貝數，共6個梯度，用于制備16S rRNA基因標準曲線。

1.3.3 熒光定量PCR 采用SYBR Green定量PCR法測定細菌16S rRNA基因豐度，反應在ABI 7500熒光定量PCR儀（ABI，CA，USA）上進行。反應體系為：SYBR?Premix Ex Taq Ⅱ（Thi RNaseH Plus）12.5 μL，上下游引物（10 μmol·L-1）各0.25 μL，ROX Reference Dye（50×）0.5 μL，DNA模板1.0 μL（1—10 ng），最后用超純水（ddH2O）補至25.0 μL。熒光定量PCR采用兩步法進行，條件為：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s；60 ℃ 1 min，40個循環。熒光定量PCR擴增效率為94.4%，2為0.999。

1.3.4 高通量測序分析 用引物338F（5′-ACT CCT ACG GGA GGC AGC A-3′）[22]和806R（5′-GGA CTA CHV GGG TWT CTA AT-3′）[23]擴增細菌16S rRNA基因V3-V4區，擴增體系和程序同1.3.2所示。每個樣品的上游引物5′端添加一段長度為8 bp的特異性多肽（barcode），用于區分樣品。回收PCR產物并測定濃度，將同一處理的多個樣品混勻，使各處理用于測序的樣品DNA濃度一致，采用Illumina MiSeq測序平臺進行雙末端（Paired-end）測序。測序服務委托上海美吉生物醫藥科技有限公司完成。

1.4 測序數據處理

對下機原始數據進行質量控制，用軟件QIIME 1.8.0對原始序列進行過濾、拼接、去除嵌合體[24]，并對序列長度進行篩選。根據特異性多肽將序列確定為最終的樣品序列。按照以下要求進行。（1）過濾read尾部質量值20以下的堿基，設置50 bp的窗口，如果窗口內的平均質量值低于20，從窗口開始截去后端堿基，過濾質控后50 bp以下的read；（2）根據PE reads之間的重疊（overlap）關系，將成對reads拼接（merge）成一條序列，最小重疊長度為10 bp；（3）拼接序列的重疊區允許的最大錯配比率為0.2，篩選不符合序列；（4）根據序列首尾兩端的特異性多肽和引物區分樣品，并調整序列方向，特異性多肽允許的錯配數為0，最大引物錯配數為2，最后獲得用于后續分析的高質量序列。

采用UPARSE 7.1軟件將優質序列聚類成操作分類單元（Operational Taxonomic Unit，OTU），閾值設置為97%[25]。采用RDP-classifier貝葉斯算法[26]對97%相似水平的OTU代表序列進行注釋，得到每個OTU的分類學信息。將不能聚類在任何分類水平已知類群的序列定義為未分類。利用Mothur 1.30.1軟件在97% 相似水平上進行α多樣性指數分析[27]。

1.5 數據分析

細菌16S rRNA基因拷貝數取對數后，用Sigma Plot 12.5軟件制圖。土壤理化性質、細菌16S rRNA基因拷貝數和α多樣性指數等數據的多重比較、方差分析和相關性分析用SPSS 20.0軟件完成。細菌群落結構的主成分分析和冗余分析用R 3.3.2軟件完成。

2 結果

2.1 不同處理土壤理化性質

長期不同施肥和灌溉處理顯著影響土壤理化性質（表1）。方差分析結果表明，施肥顯著改變了不同處理間土壤所有理化性質，灌溉顯著改變了不同處理間除C/N比（=1.06，0.377）外的其他理化性質，施肥和灌溉的交互作用顯著改變了不同處理間除有機碳（=0.467，0.638）外的其他理化性質（表1）。有機肥處理中，灌溉顯著提高了土壤含水量（＜0.001）和全氮含量（＜0.01），分別提高了2.2—6.6個百分點和6.0%—11.0%；化肥處理中，灌溉顯著提高了土壤含水量（＜0.001）、土壤pH（＜0.001）和銨態氮含量（＜0.001），分別提高了1.1—4.2個百分點、0.37—0.41個單位和2.7—5.1倍。灌溉次數相同時，施有機肥顯著提高了土壤全氮（＜0.001）和有機碳含量（＜0.001），分別提高了17.8%—27.8%和7.8%—11.7%。

表1 不同施肥和灌溉處理土壤理化性質

數據為平均值±標準差（=3）；同列數值后不同小寫字母表示差異顯著（＜0.05）。CI0，化肥+不灌溉；CI1，化肥+拔節期灌溉；CI2，化肥+拔節期灌溉+灌漿期灌溉；MI0，有機肥+不灌溉；MI1，有機肥+拔節期灌溉；MI2，有機肥+拔節期灌溉+灌漿期灌溉。*表示＜0.05，**表示＜0.01，***表示＜0.001，ns表示差異不顯著。下同

Data are means±standard deviation (n=3); Different small letters mean significant differences (＜0.05). CI0, chemical fertilizer + no irrigation; CI1, chemical fertilizer + irrigated at the jointing stage; CI2, chemical fertilizer + irrigated at the jointing and filling stages; MI0, manure fertilizer + no irrigation; MI1, manure fertilizer + irrigated at the jointing stage; MI2, manure fertilizer + irrigated at the jointing and filling stages. *＜0.05, **＜0.01, ***＜0.001, ns: not significant difference. The same as below

2.2 不同處理細菌16S rRNA基因豐度

不同施肥和灌溉處理中土壤細菌16S rRNA基因拷貝數為每克干土4.34×109—1.39×1010（圖1）。方差分析結果表明，灌溉（=137.74，＜0.01）及施肥與灌溉的交互作用（=8.92，＜0.05）顯著影響細菌16S rRNA基因拷貝數（表2）。灌溉顯著增加了細菌16S rRNA基因拷貝數（＜0.05），其中處理MI2和MI1比MI0分別提高了192.6%和75.9%，處理CI2和CI1比CI0分別提高了160.0%和126.8%。灌溉相同時，處理MI2中細菌16S rRNA基因拷貝數顯著高于CI2（＜0.05），處理MI1和CI1、MI0和CI0間差異則不顯著（＞0.05）。

相關性分析結果顯示，細菌16S rRNA基因拷貝數與土壤含水量（=0.856，＜0.001）、土壤pH（=0.675，＜0.01）和全氮含量（=0.723，＜0.01）均呈顯著正相關關系（表3）。

數據為平均值±標準差（n=3）；不同小寫字母表示差異顯著（P＜0.05）

表2 施肥、灌溉及施肥與灌溉的交互作用對細菌16S rRNA基因拷貝數和群落α多樣性指數的影響

表3 細菌16S rRNA基因豐度、群落α多樣性指數與土壤理化性質的Pearson相關性分析

2.3 測序結果和多樣性指數

利用Illumina MiSeq平臺對細菌16S rRNA基因V3-V4區測序，共得到有效序列707 759條，平均長度為438.16 bp。經抽平篩選后，每個樣品得到21 230條高質量序列，包含2 336—2 671個操作分類單元（OTU），各樣品的測序覆蓋度為0.9657—0.9698（表4）。樣品OTU稀釋性曲線均趨于平坦，表明測序深度包括了樣品中的絕大多數細菌類型，測序數據量合理。

不同處理的ACE指數為2 999—3 178，Chao1指數為3 016—3 168，香濃指數為6.84—6.98，辛普森指數為0.0019—0.0025（表4）。方差分析結果表明，灌溉顯著影響ACE指數（=10.484，＜0.05）、Chao1指數（=4.216，＜0.05）、香濃指數（=14.298，＜0.01）和辛普森指數（=5.137，＜0.05）（表2）。與不灌溉相比，灌溉處理中ACE指數、Chao1指數和香濃指數分別提高了3.0%—5.9%、2.3%—5.1%和1.2%—2.0%，辛普森指數降低了7.1%—22.7%（表4）。

相關性分析結果顯示，ACE指數與土壤含水量（=0.732，＜0.01）、土壤pH（=0.664，＜0.01）、銨態氮含量（=0.497，＜0.05）和有機碳含量（=0.529，＜0.05）均呈顯著正相關關系。Chao1指數與土壤含水量（=0.569，＜0.05）、土壤pH（=0.605，＜0.01）、銨態氮含量（=0.525，＜0.05）和有機碳含量（=0.550，＜0.05）均呈顯著正相關關系。香濃指數與土壤pH（=0.629，＜0.01）和有機碳含量（=0.471，＜0.05）均呈顯著正相關關系（表3）。

表4 不同施肥和灌溉處理細菌高通量測序結果統計

2.4 不同處理細菌的群落組成

在門水平上，共獲得39個類群。將平均相對豐度＜1%類群歸類為其他，得到17個類群（圖2-a）。其中，變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、酸桿菌門（Acidobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes）為主要優勢類群，相對豐度分別為22.82%—39.94%、11.09%—27.01%、8.93%—19.86%、5.01%—17.81%和5.45%—12.13%，合計為77.22%—86.28%。不同處理間放線菌門（＜0.001）、擬桿菌門（＜0.01）和Saccharibacteria（＜0.05）的相對豐度差異顯著。施肥顯著改變了放線菌門（=6.617，＜0.05）的相對豐度，灌溉顯著改變了放線菌門（=40.946，＜0.001）、擬桿菌門（=15.649，＜0.001）和Saccharibacteria（=9.772，＜0.01）的相對豐度。

在綱水平上，共獲得97個類群。將平均相對豐度＜1%類群歸類為其他，得到17個類群（圖2-b）。其中，放線菌綱（Actinobacteria）、-變形菌綱（Alphaproteobacteria）、酸桿菌綱（Acidobacteria）、-變形菌綱（Gammaproteobacteria）和厭氧繩菌綱（Anaerolineae）為主要優勢類群，相對豐度分別為11.09%—27.01%、8.83%—17.42%、5.01%—17.81%、6.02%—11.92%和3.24%—9.20%，合計為48.04%—61.65%。不同處理間放線菌綱（＜0.001）、-變形菌綱（＜0.01）、-變形菌綱（Deltaproteobacteria）（＜0.01）、-變形菌綱（Betaproteobacteria）（＜0.01）、纖維菌綱（Cytophagia）（＜0.05）、Saccharibacteria_norank（＜0.05）、KD4-96（＜0.05）、黃桿菌綱（Flavobacteriia）（＜0.001）、熱微菌綱（Thermomicrobia）（＜0.001）和Phycisphaerae（＜0.001）的相對豐度差異顯著。施肥顯著改變了放線菌綱（=6.617，＜0.05）和黃桿菌綱（F=6.166，＜0.05）的相對豐度，灌溉顯著改變了放線菌綱（=40.946，＜0.001）、-變形菌綱（=15.465，＜0.001）、-變形菌綱（=14.427，＜0.01）、-變形菌綱（=21.22，＜0.001）、纖維菌綱（=10.287，＜0.01）、Saccharibacteria_norank（=9.772，＜0.01）、KD4-96（=8.36，＜0.01）、黃桿菌綱（=88.045，＜0.001）、熱微菌綱（=30.1，＜0.001）和Phycisphaerae（=10.213，＜0.01）的相對豐度，施肥與灌溉的交互作用顯著改變了可熱微菌綱（=7.172，＜0.01）的相對豐度。

2.5 不同處理細菌的群落結構及其與環境因子的關系

基于OTU的層次聚類分析結果顯示，不同施肥和灌溉處理細菌群落結構差異明顯，除MI2_2外，其他處理的3個重復都聚類在一起。其中，不灌溉處理（CI0和MI0）、灌溉一次處理（CI1和MI1）和灌溉兩次處理（CI2和MI2）距離較近（圖3-a）。主成分分析進一步證實了不同處理細菌群落結構差異明顯，第一、二主成分軸對細菌群落結構變異的解釋量分別為35.44%和15.33%。其中，灌溉條件相同處理（CI0和MI0，CI1和MI1，CI2和MI2）聚集在一起，而肥料類型相同處理（CI0、CI1和CI2，MI0、MI1和MI2）相距較遠（圖3-b）。這些結果表明灌溉次數對細菌群落結構的影響強于肥料類型。

標星號表示不同處理中的相對豐度差異顯著。*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001

圖3 不同施肥和灌溉處理細菌群落結構的層次聚類樹（a）和主成分分析（b）

為進一步分析不同土壤理化性質對細菌群落結構的影響，對細菌群落結構與土壤理化性質進行冗余分析（圖4）。結果顯示，土壤含水量（＜0.001）、土壤pH（＜0.001）、全氮含量（＜0.01）、銨態氮含量（＜0.001）和有機碳含量（＜0.01）均顯著影響了細菌的群落結構。

3 討論

3.1 不同施肥和灌溉處理對細菌數量的影響

本研究利用熒光定量PCR分析了不同施肥和灌溉處理土壤細菌數量，不同處理中細菌16S rRNA基因豐度在109—1010個拷貝數，低于長期施肥水稻土中的細菌數量[6]，與長期種植小麥的相似類型旱地土壤中細菌數量級一致[28]。袁紅朝等[6]研究表明水稻土有機碳含量高（19.56—22.65 g·kg-1），可為微生物提供充足的碳源，具有較高的微生物數量。本研究中與施化肥相比，施有機肥顯著提高了土壤有機碳含量，但細菌數量和有機碳含量卻無顯著相關關系（=0.41，=0.091）。CHEN等[29]研究表明土壤類型顯著影響了水稻土氨氧化微生物的數量和群落結構，因此，土壤類型可能是引起細菌在旱地土壤和水稻土中數量差異的原因。灌溉顯著增加了細菌數量（＜0.001），與劉方春等[30]對不同干旱處理的研究結果相似。原因可能是灌溉提高了土壤含水量和土壤pH，增加了氮元素的可利用性，為細菌生長提供了充足的氮源，促進了細菌繁殖。細菌數量與土壤含水量（=0.856，＜0.001）、土壤pH（=0.675，＜0.01）和全氮含量（=0.723，＜0.01）均呈顯著正相關關系，進一步證實這些土壤理化性質顯著影響了細菌的數量。此外，施肥（=1.657，=0.22）對細菌數量的影響不顯著，而灌溉（=137.74，＜0.01）顯著改變了細菌數量，表明灌溉對細菌數量的影響強于施肥。

圖4 環境因子對細菌群落結構影響的冗余分析

3.2 不同施肥和灌溉處理對細菌多樣性的影響

多樣性指數是評價細菌群落多樣性的重要指標，多樣性指數越高表明細菌群落的豐富度和多樣性越高。袁紅朝等[6]對不同施肥水稻土壤的研究表明施肥和秸稈還田均顯著增加細菌多樣性，徐永剛等[31]研究表明施有機肥玉米土壤細菌多樣性高于施化肥，而本研究中施有機肥和化肥處理細菌群落的ACE、Chao1和香濃指數均差異不顯著，可能是由于不同地區土壤性質和作物品種差異造成。劉方春等[30]研究表明適當的干旱可提高櫻桃實生苗根際土壤的細菌群落多樣性，但過高干旱持續時間過長或者土壤含水量導致細菌群落多樣性指數降低，本研究顯示灌溉顯著增加了細菌群落的ACE、Chao1和香濃指數，表明灌溉增加了細菌的豐富度和多樣性，可能是由于灌溉后，土壤含水量增加，在一定的范圍內，土壤含氧量合適，氮、磷、鉀等無機元素和有機質等可利用性增加，為更多的微生物提供了生長和繁殖的條件。此外，土壤pH是土壤微生物生物量和細菌群落多樣性的限制因素[32-33]，土壤養分和有機碳含量也是影響細菌多樣性的重要因素[33]。本研究中，細菌群落的ACE、Chao1和香濃指數與土壤含水量、pH和有機碳含量存在一定的顯著相關關系，表明了土壤含水量、pH和有機碳是影響細菌群落多樣性的重要因素。

3.3 不同施肥和灌溉處理對群落組成和結構的影響

細菌是土壤微生物的重要組成，參與了土壤養分循環，而且對維持整個土壤生態系統的穩定性起著重要的作用[34]。本研究利用Illumina Miseq測序平臺對6個不同施肥和灌溉處理土壤細菌群落結構進行研究，得到39個門水平、97個綱水平和超過600個屬水平上的類群。結果表明，不同處理中優勢的門和綱類群相似，但不同處理門和綱水平上的優勢類群的相對豐度差異顯著（圖2-a，2-b）。各處理優勢門類群（平均相對豐度＞5%）為變形菌門、放線菌門、綠彎菌門和酸桿菌門，與孫瑞波等[15]和LIU等[33]在不同類型農田土壤中得到了細菌優勢類群相似，但不同研究中各優勢類群的相對豐度差異很大，這些結果表明農田土壤中細菌的優勢類群相似，但優勢類群的相對豐度受土壤類型或質地和種植作物品種的影響[8, 29, 35-36]。施肥和灌溉改變了土壤理化性質，因此對土壤中細菌優勢類群相對豐度也產生了一定的影響。灌溉顯著改變了放線菌門（＜0.001）、擬桿菌門（＜0.01）和Saccharibacteria（＜0.05）的相對豐度，但施肥沒有顯著改變各優勢類群的相對豐度，這些結果表明本研究中灌溉對土壤細菌群落組成的影響強于肥料類型。放線菌門能夠促進土壤中動植物殘體的腐爛，同時在土壤氮素循環中也具有一定的作用[36]。王伏偉等[32]研究發現施肥和秸稈還田顯著提高了放線菌門的相對豐度，并且土壤全氮含量是提高其相對豐度的重要原因。本研究中，有機肥和化肥處理間放線菌門相對豐度差異不顯著，有機肥處理中，灌溉增加了土壤全氮含量卻降低了放線菌門的相對豐度。放線菌門相對豐度與全氮含量（=0.047，0.853）無顯著相關關系，而與土壤含水量（=-0.799，＜0.001）和土壤pH（=-0.570，＜0.05）顯著相關，表明放線菌門的相對豐度不僅受土壤全氮含量影響，還受到土壤含水量和土壤pH的影響。

前人研究表明施肥[15,28,32]和灌溉[37]等農業管理措施對土壤細菌群落結構有一定影響。本研究發現施肥和灌溉均改變了細菌的群落結構，但不同肥料類型和灌溉次數對細菌群落結構的影響存在差異（圖3-a，3-b）。灌溉條件相同的處理具有相似的群落結構，表明灌溉對土壤細菌群落結構的影響強于肥料類型。大量研究也都證實土壤pH、全氮含量和有機碳含量顯著影響細菌的群落結構[19,33,38]。本研究中，土壤含水量（＜0.001）、土壤pH（＜0.001）、全氮含量（＜0.01）和有機碳含量（＜0.01）與細菌群落結構顯著相關，并且土壤含水量與5個主要門類群（變形菌門、放線菌門、擬桿菌門、Saccharibacteria和浮霉菌門）的相對豐度存在顯著相關關系，表明土壤含水量是影響細菌群落結構的主要原因。此外，OTU水平上全氮含量與細菌群落結構顯著相關，但門水平上全氮含量與主要門類群相對豐度均無顯著相關關系，表明全氮含量對細菌不同分類學水平上的群落結構影響存在差異。本研究中，灌溉對細菌群落結構的影響強于施肥，可能是由于灌溉提高了土壤含水量和土壤pH，這兩個因素都是影響細菌群落結構的重要因素[6, 16, 38]。

不同施肥和灌溉制度對土壤細菌群落組成和結構都有一定影響，本研究只分析了土壤細菌群落的整體變化，并未對特殊功能類群的微生物進行研究。由于這些特殊功能類群的微生物參與的土壤代謝途徑及功能的差異，不同施肥和灌溉制度引起的細菌數量、多樣性和群落結構差異是否導致土壤肥力、健康狀況和生態系統功能變化有待于進一步研究。

4 結論

4.1 長期不同施肥和灌溉制度對土壤理化性質產生了一定影響。在兩種施肥處理中，灌溉均顯著提高了土壤含水量和土壤pH，施有機肥比施化肥顯著提高了土壤有機碳含量。

4.2 灌溉次數增加顯著提高了土壤細菌數量，化肥和有機肥處理中分別提高了1.17—1.60和0.76—1.93倍；而除CI2和MI2外，不同施肥處理間細菌數量差異不顯著。灌溉顯著改變了細菌群落多樣性指數，而施肥對細菌群落多樣性指數影響均不顯著。

4.3 施肥和灌溉都改變了細菌群落組成和結構，且灌溉的作用強于施肥。此外，土壤含水量和土壤pH與細菌數量、多樣性和群落結構均存在顯著相關關系，是影響細菌群落變化的主要環境因子。

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（責任編輯 李云霞）

Effects of Long-term Different Fertilization and Irrigation Managementson Soil Bacterial Abundance, Diversity and Composition

YANG YaDong, WANG ZhiMin, ZENG ZhaoHai

(College of Agronomy and Biotechnology, China Agricultural University, Beijing 100193)

【Objective】This study was carried out to investigate the bacterial community in a wheat-maize rotation field during wheat growing season in northern China. The effects of long-term different fertilization and irrigation regimes on the abundance, diversity and composition of bacterial community were identified. It will provide evidences for further optimizing fertilization and irrigation managements, improving soil productivity, and maintaining soil microbial diversity.【Method】Based on a long-term fertilization and irrigation experiment carried out in Wuqiao Experimental Station of China Agricultural University, six different soil samples were collected after wheat was harvested, including chemical fertilization and no irrigation (CI0), chemical fertilization and irrigation at the jointing stage (CI1), chemical fertilization and irrigation at the jointing and filling stages (CI2), manure fertilization and no irrigation (MI0), manure fertilization and irrigation at the jointing stage (MI1), and manure fertilization and irrigation at the jointing and filling stages (MI2). The abundance, diversity and composition of the bacteria community in different soil samples were revealed by using real-time PCR and Illumina Miseq sequencing platform, targeting the 16S rRNA gene. Correlation analysis was carried out between soil properties and the bacteria community abundance, diversity and structure.【Result】Irrigation significantly increased soil moisture and soil pH, and manure fertilization significantly increased Total Organic Carbon (TOC) content compared with no irrigation and chemical fertilization treatments, respectively. The bacterial 16S rRNA gene copy numbers ranged from 4.34×109to 1.39×1010g-1in different treatments. Irrigation significantly increased the bacterial 16S rRNA gene copy number by 1.17-1.60 and 0.76-1.93 times in the chemical and manure fertilization treatments, respectively. The bacterial α diversity index results showed that irrigation but not fertilization significantly affected bacterial α diversity index. At the phylum level, thirty-nine phyla were obtained in all the treatments, among which Proteobacteria, Actinobacteria, Chloroflexi, Acidobacteria and Bacteroidetes were the predominant phyla, accounting for 77.22%-86.28% of the total reads. There were significant variations in relative abundance of Actinobacteria (11.09%-27.01%), Bacteroidetes (5.45%-12.13%) and Saccharibacteria (2.41%-3.77%) among different treatments. Irrigation significantly decreased the relative abundance of Actinobacteria and Saccharibacteria by 36.48%-48.03%, 22.17%-33.67% and 15.21%-45.54%, 13.40%-23.97% in the chemical and manure fertilization treatments, respectively. Hierarchical clustering and principal component analysis (PCA) results showed that both fertilization and irrigation managements affect the bacterial structure, and irrigation had a stronger effect than fertilization on the bacterial structure. In addition, there were significant correlations between soil moisture, soil pH, Total Nitrogen (TN) content, and TOC content and the abundance, α diversity index and structure of the bacterial community.【Conclusion】Irrigation greatly altered the abundance, diversity, and structure of the bacterial community, while fertilization had a minor effect on the abundance and structure of the bacterial community, and soil moisture and soil pH were the potential environmental factors associated with the bacterial community variations.

manure fertilizer; irrigation; bacterial community diversity; high-throughput sequencing; northern China

2017-06-21；

2017-08-25

國家重點研發計劃項目（2016YFD0300205-01）、國家自然基金（31671640）、國家公益性行業（農業）科研專項（201503121-11）

楊亞東，E-mail：yadong_tracy@sina.com。

曾昭海，Tel：010-62731211；E-mail：zengzhaohai@cau.edu.cn