個體化新生抗原疫苗：癌癥免疫治療的新途徑

■ 文 /閻 影

當今癌癥免疫的機理許多還不十分清楚，癌癥免疫治療的春天只是剛剛開始。

癌癥免疫治療應用研究已有將近130年的歷史。癌癥免疫領域的先驅者、美國醫生威廉·科利（William Coley）早在1893年就開始采用由化膿性鏈球菌制備的丹毒細菌毒素（后來被稱為“科利毒素”或“科利疫苗”），反復接種給晚期癌癥患者，刺激發熱和機體產生免疫反應，使一些患者的腫瘤消退。這項開創性早期工作首次提供了接種抗原性物質可能刺激人體免疫系統，達到臨床上明顯抑制腫瘤增長的直接證據。

此后，癌癥免疫治療經歷了漫長艱辛的發展，科利本人和他的“疫苗”也經歷過許多艱難的困境與挫折。直到最近幾年，癌癥免疫治療領域出現的兩個里程碑式的進展：嵌合抗原受體T淋巴細胞（CAR-T）和免疫核查點信號阻斷抗體PD-1/PD-L1的創新和臨床應用，使癌癥免疫治療真正走上了臺面，成為繼手術、化療、放療和靶向治療后又一種癌癥治療方法，并有希望成為癌癥治療的最重要手段。治療性癌癥疫苗領域經過百年的積淀，最近也獲得了重要進展。個體化新生抗原（neoantigen）癌癥疫苗的開發和應用，成為癌癥免疫治療的又一條新途徑。

癌癥疫苗

近代癌癥疫苗的研發也有幾十年了。但是，迄今為止，僅有個別產品進入臨床應用。例如人乳頭狀瘤病毒（HPV）疫苗，這種預防性癌癥疫苗只是對與病毒感染相關的癌癥具有療效。前列腺癌疫苗（Sipuleucel-T）是目前唯一得到美國食品藥品監督管理局（FDA）批準進入臨床應用的治療性疫苗，實際上這種疫苗也只能達到邊緣性的臨床效果。總體而言，與其他免疫療法比較，尤其是PD-1和T細胞治療，絕大多數治療性癌癥疫苗并沒能證明具有顯著的臨床療效。

以往，大多數癌癥疫苗多使用腫瘤相關抗原（Tumor associated antigens，TAAs)作 為 免 疫原。這些TAAs本質上是非突變的自身抗原（selfantigens），存在于正常基因組中。TAAs通常在人體正常細胞中以相對低水平表達的狀態存在，而在癌癥組織中表現為過度表達。接種以TAAs為基礎的癌癥疫苗的目的，在于激發機體產生針對相應TAAs的免疫反應，主要是激活T細胞，殺滅和清除表達該TAAs抗原的癌細胞。

然而，TAAs疫苗作為機體正常存在的自身抗原，在臨床應用上存在兩個主要的問題。首先，由于自身抗原在體內的存在可以造成免疫系統產生中樞性耐受（Central Tolerance）。換句話說，免疫系統不把這些自身抗原當作異物處理，因此，不產生強烈的抗腫瘤免疫反應。其次，在某種條件下，如果誘發了針對TAAs的強烈免疫反應，有可能造成自身免疫（autoimmunity）異常。上述因素可能是導致TAAs自身抗原疫苗臨床療效不明顯和出現不良反應的主要原因。因此，一些學者認為，選擇和開發基于基因突變產生的癌癥特異性抗原疫苗，可能是解決與TAAs有關的中樞耐受和自身免疫問題的重要途徑。

獨有新生抗原制備的癌癥疫苗只能特異性地、一對一地針對每個個體患者或腫瘤，從這種意義上來說，這是真正的、純粹的個體化治療。

新生抗原

癌癥新生抗原是體細胞突變的產物。這些癌癥特異性抗原可以來自病毒蛋白、基因翻譯后的修飾或體細胞突變（如點突變、插入和缺失、開放閱讀框架改變等）。癌細胞中普遍存在的基因突變及其產物是健康細胞和正常基因組中所沒有的，它們不僅是特異性癌癥抗原，而且由于不存在中樞性耐受的基礎環境，可能具有高度免疫原性，具備構建癌癥疫苗的理想條件。雖然對癌癥新生抗原的認識由來已久，但是直到最近新一代基因測序技術的日益完善，才有可能對大量突變的新生抗原進行識別和鑒定。通過對癌組織全外顯子基因測序，結合對人類白細胞抗原（HLA）表位結合親和力的預測，能夠對每個患者的候選癌癥新生抗原進行鑒定、評估和選擇。逐漸增多的證據顯示，以突變新生抗原為基礎的個體化癌癥疫苗具有重要的發展潛力。

新生抗原總體上也可以分為兩類：共有的和獨有的。共有的新生抗原是指某些類型癌癥和不同患者間共同存在的突變抗原，而在正常基因組中并不存在。免疫原性高的共有新生抗原有可能篩選用作廣譜的治療性癌癥疫苗，用于那些有相同突變基因的患者。大多數新生抗原都是獨特的突變抗原，在患者與患者之間、腫瘤與腫瘤之間是完全不同的。因此，獨有新生抗原制備的癌癥疫苗只能特異性地、一對一地針對每個個體患者或腫瘤，從這種意義上來說，這是真正的、純粹的個體化治療。由于相同類型腫瘤的基因突變可以有廣泛的不同，這就構成癌癥個體化免疫治療必要性的重要基礎。個性化癌癥疫苗方法也是確保使每個癌癥患者產生抗腫瘤免疫反應的最佳方法。

疫苗制備

目前，個體化新生抗原癌癥疫苗的制備過程已經逐漸系統化。其基本程序主要分3個階段：收集患者的癌癥組織和正常組織標本、新生抗原鑒定以及疫苗制備。新生抗原鑒定，首先采用全外顯子測序對比癌癥和正常組織的基因序列，獲得癌組織突變基因數據。利用突變基因編碼的新生抗原作為疫苗，要求該抗原必須具有免疫原性，換句話說，選擇的抗原接種后要能夠引發機體產生抗癌免疫反應。因此，新生抗原鑒定還要經過cDNA芯片或RNA序列（RNA-seq）檢測，依照基因表達水平來選擇合適的突變新生抗原。最后，采用生物信息學或人工智能算法，預測這些候選抗原與人類白細胞抗原（HLA）的黏附親和力（Banding affinity），據此進一步將候選抗原排序并最終決定選用哪些新生抗原。

最后階段是疫苗的制備和臨床應用。癌癥疫苗的制備有多種形式，如DNA/mRNA、合成的長鏈多肽、體外抗原沖擊的樹枝狀細胞（Pulsed DCs）和生物材料輔助疫苗等。不同類型的免疫佐劑也可以增強疫苗的免疫原性。疫苗制備工藝和免疫佐劑都是快速發展的專業領域，最終目的在于能夠提高疫苗的免疫原性和療效。最后，將新生抗原疫苗有效遞送至次級淋巴器官（如淋巴結），在那里被抗原提呈細胞（APC）捕獲并呈遞給CD8+或CD4+ T細胞等免疫效應細胞，最終產生有效的抗腫瘤免疫反應。

一些臨床和實驗研究顯示，患者癌癥新生抗原負荷量與腫瘤免疫反應發生和患者臨床預后具有明顯相關性。研究也發現，如果腫瘤有較高的新生抗原，往往伴有較強的T細胞反應，患者則有更好的臨床結果。一項對619例結直腸癌研究的資料顯示，那些有高頻率突變新生抗原的患者，往往伴有增高數量的腫瘤浸潤淋巴細胞（Tumor Infiltration Lymphocytes，TILs），而且獲得存活率的改善。在有效的抗腫瘤免疫治療中，如使用PD-1、CTLA-4或TILs治療的患者，常常發現有新生抗原特異性T細胞群體的擴增。此外，體外實驗顯示，人和動物的新生抗原特異性T細胞能直接殺傷表達突變抗原的腫瘤細胞，并在動物模型中能完全抑制腫瘤生長或導致腫瘤縮小。

臨床應用

有關癌癥新生抗原疫苗的臨床應用，最近有兩項早期工作的報道。美國波士頓達納-法伯癌癥研究所（DFCI）使用合成的長鏈新生抗原多肽，以Poly IC:LC為免疫佐劑制備疫苗治療黑色素瘤患者。每例疫苗包含多達20條預測的個體化新生抗原多肽，臨床試驗結果證明，該疫苗使用具有可行性、安全性和免疫原性。疫苗誘導產生多功能CD4+和CD8+ T細胞，在患者間使用的97條獨有新生抗原中，CD4+ T細胞能識別58條（占60%）, CD8+ T細胞能識別 15條（占16%）。這些T細胞能夠對突變抗原和野生型抗原加以區別，并且在某些情況下能直接識別殺死自體腫瘤細胞。6名患者中，4名在接種疫苗后25個月仍未復發，而2名復發患者隨后接受PD-1藥物治療，復發腫瘤完全消退，并出現新生抗原特異性T細胞的擴增。這些資料為深入開發個體化疫苗技術，無論是單獨接種，還是聯合PD-1或與其他免疫療法聯合使用，提供了有力證據。

德國研究人員采用RNA為基礎的新生抗原疫苗治療晚期黑色素瘤。合成的mRNA 編碼多個新生抗原決定簇（poly-neoepitopes），經淋巴結接種疫苗。免疫接種后，在所有治療的13例患者中均成功誘導了針對多種新生抗原的有效T細胞應答。與達納-法伯癌癥研究所的結果類似，盡管預測選擇的多為高親和力的HLA-I型新生抗原，但大多數新生抗原誘發的是HLA-II型限制性CD4+ T細胞的應答反應。免疫后隨訪期，8例患者仍處于無腫瘤復發狀態（接種后12～24個月）。5例復發患者中，1例病情進展后，采用PD-1治療獲得完全緩解；1例后期復發患者對疫苗和PD-1治療均無反應，最終死亡，復發腫瘤標本檢查分析顯示，該患者β2微球蛋白等位基因均出現缺失，可能是導致后期對免疫治療缺乏反應的原因；其余3例患者，均有程度不同的針對新生抗原的免疫反應存在。這些結果也證明mRNA新生抗原個體化癌癥疫苗同樣具有重要的發展潛力。

重重挑戰

像許多新概念剛剛出現一樣，學界往往存在不同的觀點和評價。許多學者認為，突變新生抗原個體化癌癥疫苗是繼CAR-T和PD-1之后，腫瘤免疫治療又一個里程碑式的進展。也有學者認為，新生抗原是很早就有的名詞，以往包括病毒和原癌基因編碼的非突變型新生抗原，由于現在概念限定于隨機突變基因，使之引起越來越多的特別關注。這些學者也認為，突變型新生抗原是否比非突變型新生抗原更具有免疫原性，還需要大量工作加以證實。雖然突變型新生抗原概念出現和作為個體化免疫治療新方式迅速進入臨床試驗，但是其制作工藝屬于勞動密集型個人定制的方式，目前可能是一種昂貴的療法。因此，在疫苗開發中沒必要去競爭，或取代那些傳統研發的基于非突變共有新生抗原的癌癥疫苗，后者是可以廣泛適用、現成產品、具有成本效益、價格便宜的非個體化癌癥疫苗。目前，在大量突變新生抗原中篩選有明顯療效的片段仍然是難度較高的工作。此外，如何對付疫苗接種后癌細胞出現的新型突變導致的抗原逃逸，以及如何保證所有癌細胞都存在疫苗選擇的特異性突變，以避免免疫逃逸，都可能是新生抗原疫苗將要面對的挑戰。

從科利開始的癌癥免疫治療到現在已是百年變遷，CAR-T、PD-1乃至個體化突變新生抗原癌癥疫苗的出現，終于迎來了癌癥免疫治療的春天。考慮到CAR-T在實體腫瘤中面臨的瓶頸和PD-1藥物只在大約20%的癌癥患者中有持久療效，當今癌癥免疫的機理許多還不十分清楚。因此，癌癥免疫治療的春天只是剛剛開始。