3種粒徑納米氧化鋅與常規氧化鋅對大鼠的亞慢性毒性

洪麗玲，張天寶*

（1．上海化工研究院有限公司檢測中心，上海200062；2．中國人民解放軍海軍軍醫大學熱帶醫學與公共衛生學系衛生毒理學教研室，上海200433）

納米材料的生物學反應與其表面效應、體積效應和量子尺寸效應有關。現有資料表明，金屬氧化物等納米材料能誘導氧化應激和自由基的生成，造成多種毒性損傷，且納米粒徑越小毒性越大[1-2]。目前，納米氧化鋅(ZnO)已應用于工業和化妝品產品，在橡膠制品、油漆涂料、化纖紡織、醫學診斷和治療等領域具有廣泛的應用前景，因此其安全性越來越受到關注。國內外已經對納米ZnO的毒性開展了很多研究。有報道指出，納米ZnO可能表現出細胞毒性、遺傳毒性、氧化應激、線粒體功能障礙和凋亡、神經毒性以及炎癥反應[4-6]；另有一些體內的短期毒性研究指出納米ZnO的靶器官可能是肝臟、脾臟、肺、腎臟和心臟[7-9]。但目前尚缺乏對納米ZnO和常規ZnO慢性或亞慢性毒性和毒作用的比較資料。因此，本研究以3種粒徑納米ZnO和常規ZnO為對象，通過腹腔注射方式觀察其對SD大鼠的亞慢性毒性，比較兩者的毒作用特征，擬為納米ZnO及其他納米物質的安全性評價積累資料。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

納米ZnO(粒徑30、50和100 nm)，白色粉末，平均粒徑約10 nm，比表面積＞10～60 m2/g，表面電阻1×105～1×1010Ω，水懸浮液pH值6.0～8.0，純度≥99.9%，購自杭州萬景新材料有限公司；常規ZnO(顆粒直徑≤1 μm，購自Sigma)。天冬氨酸轉氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、丙氨酸轉氨酶(alanine aminotransferase，ALT)測定試劑盒購自日本WAKO公司；尿素氮(urea n itrogen，BUN)、肌酐(creatinine，CRE)試劑盒購自德國Roche公司。ADVIA2120 血液細胞分析儀(拜耳，德國)、7080全自動生化分析儀(HITACHI，日本)、BX43 光學系統顯微鏡(Olympus，日本)。

1.2 動物分組及染毒

SPF級SD大鼠40只購自上海必凱實驗動物有限責任公司[合格證號SCXK(滬)2013-0016]，體質量120～140 g，雌雄各半，按體質量隨機分為分5組，分別為3種粒徑的納米ZnO(30、50、100 nm)和常規ZnO(≤1 μm)染毒組及陰性對照組(注射等體積生理鹽水)，每組8只，雌雄各半。大鼠在SPF級實驗動物室飼養，自由進食和飲水。溫度為17～26 ℃，相對濕度為40%～70%，明暗周期為12 h/12 h。動物檢疫1周后開始試驗。

將納米ZnO和常規ZnO分別用生理鹽水制成混懸液，使用前超聲30 min，并用漩渦攪拌器不斷攪拌，無菌操作下，以10 mg/kg連續腹腔注射42 d[10]，給藥體積按10 μL/g。

1.3 觀察指標

1.3.1 一般狀況及體質量觀察 試驗期間對動物的一般狀況進行觀察并記錄體質量變化情況。

1.3.2 血象及血清生化學指標檢測 停藥后第2天進行腹主動脈取血，取2 mL全血EDTA-K2抗凝后進行紅細胞數目(red blood cell，RBC)、血紅蛋白(hemoglobin， HGB)、 白 細 胞 數 目 (white blood cell count，WBC)、中性粒細胞比例(neutrophil ratio，NEUT)、血小板數目(blood platelet，PLT)、淋巴細胞比例(lymphocyte ratio， LYMPH)和 單 核 細 胞 計 數 (monocyte count，MONO)血象檢查。另取5 mL全血待自然凝固后取血清進行ALT、AST、BUN、CRE等生化指標檢測，分析肝腎功能的變化。

1.3.3 臟器系數計算 解剖動物，取肝、腎、脾、肺、睪丸臟器，生理鹽水沖洗血污，濾紙輕輕拭干，稱取質量，按下式計算臟器系數。

臟器系數=臟器濕質量/體質量×100

1.3.4 組織病理學檢查 10%福爾馬林固定主要器官(肝臟、腎臟、脾臟、肺臟及睪丸)，常規石蠟包埋、切片、HE染色，光學顯微鏡下觀察。

1.3.5 精子涂片制作 剖開腹腔，暴露睪丸，分離兩側附睪，用眼科剪剖開附睪組織，與適量生理鹽水混勻、涂片、固定、染色和觀察。

精子畸形率(%)=畸形精子數/受檢精子總數×100%

1.3.6 細胞凋亡的檢測 用TUNEL法進行大鼠睪丸組織細胞凋亡的原位檢測，二氨基聯苯胺(3，3′-diaminobenzidine，DAB)顯色后，光學顯微鏡下觀察。每例切片計數5個400倍視野，以平均每100個細胞中含凋亡細胞的個數作為凋亡指數(apoptosis index，AI)。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 一般狀況及體質量變化

試驗期間，各組動物的一般活動表現、攝食、飲水、分泌物和糞便性狀正常，外觀均無明顯異常，無動物死亡。體質量是反應中毒后綜合性變化的指標。由表1可見，各染毒組與對照組相比，大鼠體質量增長的差異均無統計學意義(P均＞0.05)。

表1 不同種類ZnO染毒不同時間大鼠體質量的變化(-x±s，n=8)

2.2 臟器系數

由表2可見，與對照組比較，30 nm ZnO組的肝、脾、腎的臟器系數升高；50 nm ZnO組脾的臟器系數升高；100 nm ZnO組肝的臟器系數升高；常規ZnO組肺、腎的臟器系數升高，差異均具有統計學意義(P均＜0.05)。與常規ZnO組比較，30和50 nm ZnO組脾的臟器系數均升高；30、50和100 nm ZnO組肺的臟器系數均下降，差異均有統計學意義(P均＜0.05)。

表2 不同種類ZnO染毒大鼠臟器系數的變化(，n=8)

表2 不同種類ZnO染毒大鼠臟器系數的變化(，n=8)

與對照組相比，*P＜0.05；與常規ZnO組相比，#P＜0.05.

組別 肝 脾 肺 腎 睪丸納米ZnO 30 nm 10.01±2.06* ，#1.06±0.20* #1.70±0.17 2.44±0.40* 3.02±0.21 50 nm 9.54±1.96 ，#0.95±0.18* #1.64±0.19 2.34±0.52 3.02±0.09 100 nm 10.77±2.32* 0.90±0.22 #1.83±0.21 2.49±0.52 2.96±0.33常規ZnO 9.61±2.26 0.78±0.12 1.96±0.22* 2.39±0.55* 3.34±1.23對照組 9.06±1.55 0.77±0.11 1.76±0.28 2.28±0.45 3.02±0.09

2.3 血象指標

由表3可見，與對照組相比，3種粒徑納米ZnO組和常規ZnO組的RBC、NEUT比例和PLT均明顯升高(P＜0.05)，而LYMPH下降(P＜0.05)；30、50 nm ZnO組的HGB均明顯下降(P＜0.05)；僅30 nm ZnO的WBC增加(P＜0.05)。與常規ZnO組比較，30、50 nm ZnO組的HGB下降，而PLT明顯升高(P＜0.05)，30 nm ZnO組的WBC顯著升高(P＜0.05)。

表3 不同種類ZnO染毒對大鼠血象指標的影響(，n=8)

表3 不同種類ZnO染毒對大鼠血象指標的影響(，n=8)

與對照組相比，*P＜0.05；與常規ZnO組相比，#P＜0.05.

組別 -6 RBC(10/μL) HGB(g/dL) -3 WBC(10/μL) NEUT(%) LYMPH(%) MONO(%) PLT(μL/L)納米ZnO 30 nm 9.48±0.63* ，#139.00±4.28* ，#10.37±2.61* 27.40±7.57* 68.24±7.52* 3.05±1.09 ，#1.82±0.23*50 nm 9.50±0.76* ，#133.88±6.66* 9.62±3.29 35.21±9.58* 59.81±9.73* 3.54±0.94 ，#1.88±0.16*100 nm 9.36±0.40* 149.25±4.56 9.67±4.32 27.80±8.12* 67.18±7.60* 3.50±0.62 1.62±0.15*常規ZnO 9.14±0.73* 148.50±5.10 6.30±2.29 30.38±9.56* 65.19±10.20* 3.41±1.14 1.57±0.08*對照組 8.59±0.57 145.88±4.42 6.26±1.85 14.43±2.55 80.40±3.56 4.09±1.42 1.35±0.13

2.4 血清生化指標

由表4可見，與對照組比較，3種粒徑納米ZnO組和常規ZnO組的ALT均下降(P＜0.05)，AST/ALT值升高(P＜0.05)；30 nm ZnO組的BUN升高(P＜0.05)。與常規ZnO組比較，3種粒徑納米ZnO組的BUN均上升(P＜0.05)；30和50 nm ZnO組的AST均下降(P＜0.05)。各組間血清CRE含量差異均無統計學意義(P均＞0.05)。

表4 不同種類ZnO染毒對大鼠血清生化學指標的影響(，n=8)

表4 不同種類ZnO染毒對大鼠血清生化學指標的影響(，n=8)

與對照組相比，*P＜0.05；與常規ZnO組相比，P＜0.05.

組別 ALT(U/L) AST(U/L) AST/ALT BUN(mmol/L) CRE(μmol/L)納米ZnO 30 nm 468.86±140.21* #1 187.57±91.79 2.69±0.70*7.40±0.93* 30.83±3.31 50 nm 484.38±60.04* #，#1 153.75±138.68 2.40±0.26* #7.01±1.16 30.01±2.95 100 nm 511.75±50.71* 1 284.12±95.93 2.52±0.22* #7.11±1.10 29.28±4.38常規ZnO 520.63±93.05* 1 338.13±105.10 2.67±0.57* 6.15±1.25 30.28±10.55對照組 662.63±80.46 1 276.13±76.36 1.94±0.18 6.38±0.97 28.08±3.50

2.5 精子畸形情況

由表5可見，僅30及50 nm ZnO組誘發的精子畸形率高于對照組，差異均有統計學意義(P均＜0.05)。納米ZnO引起的精子形態改變有：無定形、無鉤、香蕉形、胖頭、尾折疊等。

表5 不同種類ZnO染毒對雄性大鼠精子畸形的影響(，n=4)

表5 不同種類ZnO染毒對雄性大鼠精子畸形的影響(，n=4)

與對照組相比，*P＜0.05.

組別 受檢精子總數(個) 畸形精子數(個) 畸形率(%)納米ZnO 30 nm 4 200 44 1.05±0.29*50 nm 4 458 26 0.81±0.27*100 nm 4 128 30 0.73±0.23常規ZnO 4 094 26 0.63±0.20對照組 4 462 11 0.24±0.20

2.6 大鼠臟器的組織病理學觀察

睪丸組織除對照組和常規ZnO組各級生精細胞層次清晰外(圖1A和1B)，3種納米ZnO均對大鼠睪丸組織有明顯影響。100 nm ZnO組管壁上生精細胞數量少于對照組，層次稍微減少，排列稍紊亂(圖1C)；50 nm ZnO組睪丸組織管壁上生精細胞數量明顯少于對照組，層次亦明顯減少，排列紊亂，分層不明顯，形成不規則空隙，但睪丸間質未見炎細胞浸潤(圖1D)；30 nm ZnO組睪丸組織管壁上生精細胞數量明顯少于對照組，管腔內精子極少，個別曲細精管內僅見緊靠基膜的支持細胞及精原細胞，而其余各級生精細胞及精子消失，表現為生精阻滯，曲細精管內生精細胞部分脫落，阻塞于管腔內，或生精細胞排列紊亂，但睪丸間質未見炎細胞浸潤(圖1E)。其余各染毒組的肝臟、腎臟、脾臟、肺臟均未見明顯組織病理學改變。

2.7 大鼠睪丸組織細胞凋亡情況

TUNEL檢測顯示，正常大鼠生精小管偶見生精細胞凋亡(圖2A)，納米ZnO組細胞凋亡明顯，凋亡細胞核呈棕褐色，核呈固縮狀、或染色質向周邊聚集、或呈核碎片狀，大多數凋亡為初級精母細胞(圖2B～2E)。由圖2F可見，納米ZnO各組凋亡指數與對照組比較均升高，差異均有統計學意義(P＜0.05)，且凋亡指數隨著納米ZnO粒徑的下降而上升(P＜0.05)。而常規ZnO組與對照組的細胞凋亡指數差異無統計學意義(P＞0.05)。

3 討論

現有的短期體內或體外毒性研究資料表明，納米ZnO的作用靶器官是肝臟[11-12]， Li等[8]的研究結果表明采用口服或者腹腔注射的方式可導致納米ZnO在肝、肺、脾和腎中積累，納米ZnO還可能引起炎癥，肝細胞壞死和脫落[13]。本研究結果顯示，納米ZnO可導致肝、脾、腎多個臟器系數改變，且粒徑越小的納米ZnO受影響的臟器越多，如30 nm ZnO組肝、脾、腎的臟器系數均升高，而50和100 nm ZnO組均只有一個臟器系數改變。另外，納米ZnO導致的臟器系數的臟器與常規ZnO有差異。推測與納米ZnO的表面效應、體積效應和量子尺寸效應有關[11]。

本研究的血象指標顯示，納米ZnO和常規ZnO均可引起骨髓紅細胞增生活躍的增生性貧血現象，但納米ZnO明顯比常規ZnO嚴重，并且納米ZnO的作用有隨粒徑下降而增強的趨勢。以往研究表明，過量的常規鋅和鋅化合物會誘發機體產生貧血[14-15]。推測動物過量攝入鋅會阻礙機體吸收銅和鐵，從而導致生長障礙和貧血。本研究還發現，納米ZnO和常規ZnO組的LYMPH及NEUT比例較對照組均顯著變化(P＜0.05)，30 nm ZnO組的WBC數與對照組和常規ZnO組比較差異均有統計學意義(P＜0.05)。研究還觀察到納米ZnO和常規ZnO組均能誘導PLT顯著升高(P＜0.05)，血小板數有隨著粒徑下降而增高的趨勢。對于血小板數的改變可能是由于大鼠出現增生性貧血、骨髓造血活躍，導致血小板增生所致，但對于上述白細胞的改變，因無其他證據，原因尚不清楚。

血清生化學指標顯示，與對照組比較，30 nm ZnO組的肝、腎功能均有明顯改變，其他粒徑納米ZnO和常規ZnO僅有肝功能的輕度改變。Wang等[14]在一次灌胃給予5 g/kg納米ZnO和常規ZnO對小鼠的急性毒性作用的比較中觀察到納米和常規ZnO均可能導致肝、腎功能改變，常規ZnO對肝功能的影響比納米ZnO嚴重，而對腎功能的影響兩者無明顯差別。這是由于大小鼠的種間差異還是由于劑量和作用時間的差異所致有待進一步研究。但研究結果均提示肝、腎可能是納米ZnO的作用靶器官。

圖1 不同種類ZnO染毒后睪丸的組織病理學改變(HE，×400)

圖2 不同ZnO染毒組大鼠睪丸生精細胞的凋亡情況(DAB，×400)

本研究還觀察到，3種粒徑納米ZnO組導致睪丸組織細胞排列紊亂，分層不明顯，形成不規則空隙，TUNEL法檢測可見生精細胞的凋亡，而對照組和常規ZnO組無明顯病理改變和生精細胞凋亡。30 nm和50 nm ZnO組還可導致精子畸形率增高。郭利利等[10]采用隔天腹腔注射200和500 mg/kg的納米ZnO(直徑30 nm)共5次，停藥1周后，觀察其對雄性ICR小鼠的急性毒性。結果也發現，活精子率降低、精子畸形率升高(P＜0.05)；500 mg/kg組上述指標變化差異均有統計學意義(P＜0.05)。TUNEL檢測顯示，納米ZnO處理后睪丸生精細胞凋亡率增加(P＜0.05)。研究結果表明睪丸是腹腔注射暴露條件下納米ZnO較為敏感的靶器官。

綜上所述，納米ZnO的亞慢性毒性明顯高于常規ZnO；納米ZnO的作用靶器官可能是睪丸、肝、骨髓和腎；且有隨著粒徑的降低，受影響的器官數和損傷程度加重的趨勢。而常規ZnO的作用靶器官是骨髓，另外肝、腎和肺也有可能，但還需要進一步驗證。

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