貝伐單抗動脈介入超選化療對大鼠腦膠質瘤的影響

高 飛，王英濱

（1．中國醫科大學附屬第四醫院，遼寧沈陽110032；2． 沈陽醫學院附屬中心醫院，遼寧沈陽 110024）

膠質瘤是顱內最常見的惡性腫瘤，在所有顱內腫瘤中約占44.69%。膠質瘤由于浸潤性生長方式及侵襲性強的特性，目前單純用任何一種方法均不能徹底根治，極易復發，預后較差[1]。由于腦膠質瘤患者生存期和生存質量較差，因此給患者及其家庭造成沉重的負擔。近年來，醫護工作者逐漸重視膠質瘤的綜合治療，包括化療、放療、生物治療及其他治療等。

化療是膠質瘤治療中重要的一環，由于人體大腦具有血腦/瘤屏障，藥物很難通過；膠質瘤中藥物有效濃度較低，腫瘤對藥物的敏感性不夠以及藥物對全身的毒副作用等因素影響了臨床療效。研究[2]發現，動脈內注射化療藥物可以增加膠質瘤內部的藥物含量。目前超選擇性動脈化療藥物較多，其中順鉑(cisplatin，CDDP)是無機重金屬化合物，為細胞周期非特異性藥物，主要干涉DNA與RNA相關蛋白質的合成。貝伐單抗(bevacizumab，BVZ)是一種重組的人類單克隆IgG1抗體，通過抑制人類血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的生物學活性而起作用。目前研究顯示BVZ與其他化療藥物聯用可很大程度上改善腦膠質瘤的治療[3]。但是，BVZ是否能夠單藥治療復發性惡性膠質瘤方面的研究尚無報道。因此，本研究對C6膠質瘤大鼠模型進行動脈介入超選化療，分別應用CDDP和BVZ作為化療藥物，探討動脈介入超選化療應用BVZ對膠質瘤的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

C6膠質瘤細胞[美國菌種保藏中心(ATCC)]；Wistar大鼠，體質量180～200 g(中國醫科大學實驗動物中心)；貝伐單抗(瑞士Roche公司)。RPMI-1640培養基(美國Sigma公司)；VEGF、P21蛋白(P21)、B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、金屬基質蛋白-2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2) 抗體均購于美國Santa Cruz Biotechnology公司；辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠、山羊抗兔IgG二抗均購于北京中杉金橋生物技術有限公司；VEGF、P21、Bcl-2 和MMP-2引物購自生工生物工程(上海)股份有限公司；Real time-PCR試劑盒購自大連TaKaRa公司。

1.2 儀器與設備

腦立體定向儀(美國Stoelting公司)，倒置顯微鏡(日本Olympus公司)，-80 ℃超低溫冰箱(日本SANYO公司)，臺式低溫超速離心機(德國Sigma公司)，超凈工作臺(蘇州凈化設備集團)，CO2恒溫培養箱(美國Thermo Scientific公司)，聚丙烯酰胺凝膠電泳裝置(美國Bio-Rad公司)，轉印儀(北京市六一儀器廠)，Las3000成像系統(日本FUJIFILM公司)，凝膠成像分析軟件(江蘇捷達科技有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 C6細胞培養 C6膠質瘤細胞復蘇成功后，重懸于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養液中，于37℃、CO2體積分數為5%的培養箱中培養，次日更換培養液，繼續培養，觀察細胞生長狀況。

1.3.2 建立腦膠質瘤動物模型 60只SPF級SD大鼠(合格證號211002300016826)，由中國醫科大學實驗動物中心提供，雄性，體質量180～200 g。大鼠用10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射進行麻醉，頭部固定在腦立體定位儀上。常規消毒后，沿中線縱向切開頭皮約1 cm，暴露顱骨。根據大鼠頭部立體定向解剖圖譜確定對應于右腦尾狀核的鉆孔位置：冠狀縫與矢狀中線交點處前1 mm，矢狀縫右3 mm。微量進樣器抽取C6細胞懸液10 μL(含1×105個細胞)，注射速度為1 μL/min，緩慢拔針。骨孔用牙托粉迅速封閉。縫合切口后，肌注青霉素0.1 mL，繼續飼養。

1.3.3 實驗動物分組及治療 C6膠質瘤細胞種植后第7天開始，將建模成功的55只大鼠隨機分為5組，每組11只：對照組(經尾靜脈注射等量生理鹽水)、靜脈注射順鉑組(V+CDDP，經尾靜脈注射5 mg/kg CDDP[4])、靜脈注射貝伐單抗(V+BVZ，經尾靜脈注射5 mg/kg BVZ[5])、動脈注射順鉑組(A+CDDP，經頸動脈注入5 mg/kg CDDP)和動脈注射貝伐單抗組(A+BVZ，經頸動脈注入5 mg/kg BVZ)。隔天注射1次，持續7 d。

1.3.4 各組大鼠腫瘤體積的測量 給藥治療7 d后，稱體質量，10%水合氯醛將大鼠麻醉，生理鹽水灌流，后經4%的多聚甲醛灌流。斷頭取腦膠質瘤組織，放入30%蔗糖中脫水2 d，4%多聚甲醛固定24 h，液氮速凍后在-25 ℃的恒冷冰凍切片機上切片，厚度為8 μm，行HE染色。應用MCID圖像分析軟件測量計算腦膠質瘤的病灶區面積，按下式計算腦腫瘤的體積：

腦腫瘤的體積=面積總和×組織間隔厚度

1.3.5 Real time-PCR檢測mRNA表達 給藥治療7 d后，取50 mg大鼠腦膠質瘤組織，提取RNA，檢測濃度及D(260)/D(280)。按試劑盒說明書反轉錄為cDNA，引物如下：VEGF，上游引物5'-GGTGAGAGGTCTAGTTC CCGA-3'，下游引物5'-CCATGAACTTTCTGCTCTTC-3'；p21，上游引物5'-AGTAGACACGAAACAGGC-3'，下 游 引 物5'-TTCCCATCTTTGCTCATC-3'； Bcl-2， 上游引物5'-CGGGAGAACAGGGTATGA-3'，下游引物5'-CAGGCTGGAAGGAGAAGAT-3'； MMP-2： 上 游 引 物5'-GGAAGCATCAAATCGGACTG-3'，下游引物5'-GG GCGGGAGAAAGTAGCA-3'。反應條件：94 ℃、3 min，94 ℃、30 s，60 ℃、1 min，72 ℃、1 min(30個循環)，72 ℃、2 min。mRNA相對表達差異采用2-ΔΔCT法計算，進行比較。

1.3.6 Western blot檢測蛋白表達 給藥治療7 d后，取50 mg大鼠腦膠質瘤組織，提取蛋白。腦組織在預冷的組織裂解液中剪碎，勻漿約1 min，冰浴30 min，17 000 r/min、4 ℃離心1 h，收集上清。加入樣品緩沖液，然后將樣品置于沸水浴中加熱5 min使蛋白質變性。8% SDS-PAGE電泳后進行轉印，5%脫脂奶粉4 ℃封閉過夜，第2天加入稀釋的一抗(1∶200)，室溫2 h，漂洗3次后，加入稀釋的相應二抗(1∶5 000)，室溫2 h。漂洗3次，發光顯色，Quantity One軟件對各組蛋白條帶光密度進行分析。

1.4 統計學分析

實驗數據采用SPSS for Windows18.0軟件進行統計-學分析。數據以x±s表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，以α=0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1 不同治療方法對大鼠腫瘤體積的影響

對照組大鼠腦膠質瘤體積為(9.02±0.74) mm3，V+CDDP組的腫瘤體積為(7.67±0.70) mm3、V+BVZ組為(6.57±0.69) mm3、A+CDDP組為(5.58±0.37) mm3、A+BVZ組為(4.81±0.20) mm3，均較對照組明顯減小，差異均有統計學意義(P＜0.01)；且A+CDDP組腫瘤體積較V+CDDP組相明顯縮小(P＜0.01)，A+BVZ組腫瘤體積較V+BVZ組明顯較小(P＜0.01)，結果顯示，動脈注射具有較強的抑制膠質瘤體積的作用。同時，V+BVZ組腫瘤體積顯著小于V+CDDP組，差異具有統計學意義(P＜0.01)，A+BVZ組腫瘤體積顯著小于A+CDDP組，差異具有統計學意義(P＜0.05)，提示BVZ對膠質瘤的抑制作用較CDDP更強，見圖1。

圖1 不同治療方法對大鼠腦膠質瘤體積的影響(n=11)

2.2 不同治療方法對大鼠腦膠質瘤VEGF、P21、Bcl-2和MMP-2 mRNA表達水平的影響

利用Real time-PCR方法測定各組大鼠腦膠質瘤組織中相關基因的表達(見圖2)。結果顯示，V+CDDP組、V+BVZ組、A+CDDP組和A+BVZ組的VEGF、Bcl-2及MMP-2的mRNA表達與對照組相比均明顯降低，差異均有統計學意義(P均＜0.05)；同時，P21的mRNA表達明顯增多，差異亦均有統計學意義(P均＜0.05)。與V+CDDP組相比，A+CDDP組的VEGF、Bcl-2及MMP-2的mRNA表達均顯著降低(P＜0.05)，A+BVZ組上述各mRNA表達也顯著低于V+BVZ組(P＜0.05)。另外，A+CDDP組P21的mRNA表達較V+CDDP組顯著升高(P＜0.01)， A+BVZ組 P21的 mRNA表 達 也 顯 著 高 于V+BVZ組(P＜ 0.01)，結果顯示，動脈注射降低VEGF、Bcl-2以及MMP-2的作用以及提高P21蛋白的作用更顯著。此外，V+BVZ組VEGF、Bcl-2和MMP-2的mRNA表達顯著低于V+CDDP組(P＜0.05)，A+BVZ組上述各mRNA表達也顯著低于A+CDDP組(P＜0.05)。而V+BVZ組P21的mRNA表達較V+CDDP組顯著升高(P＜0.05)。

圖2 不同治療方法對大鼠腦膠質瘤VEGF、P21、Bcl-2和MMP-2 mRNA表達的影響(n=5)

2.3 不同治療方法對大鼠腦膠質瘤VEGF、P21、Bcl-2和MMP-2蛋白表達的影響

Western blot檢測的各組大鼠腦膠質瘤組織中相關蛋白的表達情況見圖3。統計分析結果顯示，V+CDDP組、V+BVZ組、A+CDDP組和A+BVZ組的VEGF、Bcl-2、MMP-2表達與對照組相比均明顯降低，差異均有統計學意義(P均＜0.05)；同時，P21蛋白表達明顯增多，差異亦有統計學意義(P＜0.05)。A+CDDP組VEGF、Bcl-2和MMP-2蛋白表達與V+CDDP組相比均顯著降低(P均＜0.05)，A+BVZ組上述蛋白表達也均顯著低于V+BVZ組(P均＜0.05)。A+CDDP組P21表達較V+CDDP組顯著升高(P＜0.05)，A+BVZ組P21表達也顯著高于V+BVZ組(P＜0.01)，結果顯示，動脈注射降低VEGF、Bcl-2及MMP-2的表達與升高P21蛋白表達的作用較靜脈注射更顯著。此外，V+BVZ組VEGF、Bcl-2和MMP-2蛋白的表達顯著低于V+CDDP組(P＜0.05)，A+BVZ組上述蛋白表達也顯著低于A+CDDP組(P＜0.05)。V+BVZ組P21蛋白表達較V+CDDP組顯著升高(P＜0.05)，A+BVZ組P21蛋白表達也顯著高于A+CDDP組(P＜0.05)。結果顯示，BVZ降低VEGF、Bcl-2和MMP-2蛋白的表達與升高P21蛋白的作用較CDDP更顯著。

圖3 不同治療方法對大鼠腦膠質瘤VEGF、P21、Bcl-2及MMP-2蛋白表達的影響(n=5)

3 討論

膠質瘤傳統的靜脈化療因血腦屏障和血瘤屏障的制約，療效明顯受限。隨著神經介入技術的飛速發展，經動脈超選化療，由于其可能克服經靜脈化療的局限正受到越來越多的關注[6]。 Tomokatsu等[7]發現經動脈灌注可以使嘧啶亞硝脲(nimustine，ACNU)更易進入腫瘤及瘤周組織，而灌注前10 min輸入20%甘露醇可使腫瘤及瘤周組織中的ACNU濃度達到最高。Levin 等[8]研究表明，灌注側的藥物濃度比同劑量靜脈用藥高4倍。在灌注時用定量輸液泵快速輸入化療藥物，可避免藥物在血流中形成層流，促進藥物在遠端各血管分支內均勻分布，達到最大療效。劉灃等[9]發現單次經頸內動脈灌注ACNU較單次經靜脈灌注能更有效地抑制腦膠質瘤的生長。還有研究結果發現[10]，經動脈灌注途徑對大鼠腦膠質瘤進行化療，增加化療藥物的療效，能更有效控制腫瘤的生長。本實驗結果顯示，動脈注射CDDP和BVZ后，大鼠腦膠質瘤體積較對照組明顯縮小，并且與靜脈注射相比均具有較強的抑制膠質瘤生長的作用。膠質細胞瘤一般有一條或兩條主要動脈供血，研究認為腫瘤組織動脈的血流率低，動脈灌注化療藥物可以直接將藥物送到腫瘤位置，減少體內循環，提高腫瘤內藥物的作用濃度[11-12]，藥物的半衰期短，而對周圍腦組織及全身各系統的毒副作用減少，故動脈超選化療是治療腦膠質瘤的最佳途徑。

腦膠質瘤通常存在異常過度的血管生成，而促血管形成因子血管內皮生長因子A(VEGFA)的高表達與此過程密切相關[13]。BVZ是人工合成的VEGF單克隆抗體，以VEGF為靶點競爭性結合VEGF受體，從而抑制內皮細胞的有絲分裂和血管生成，達到阻斷腫瘤的血液供應的效果，最后抑制腫瘤在體內擴散。有報道顯示，BVZ可作為單一用藥及聯合其他化療藥物用來治療如轉移性結腸癌、肺癌等其他實體性惡性腫瘤[14]。Hacibekiroglu等[15]使用BVZ單藥治療復發性膠質瘤患者，結果發現20%達到部分緩解，38%病情穩定。日本一項研究結果顯示[16]使用BVZ單藥治療復發性高級別膠質瘤 患者，疾病緩解率為27.6%。本研究結果將BVZ應用治療腦膠質瘤大鼠，也發現BVZ對膠質瘤具有較強的抑制作用。

另外VEGF與膠質瘤異常過度的血管生成有關[17]，P21是細胞周期蛋白依靠性激酶抑制劑家族中的重要成員，它通過抑制周期素依賴激酶復合物活性，將腫瘤抑制作用與細胞周期控制過程緊密相連[18]。Bcl-2在細胞凋亡過程中起到抑制細胞凋亡的作用[19-20]。基質金屬蛋白酶2(MMP-2)，幾乎能降解細胞外基質(extracellular matrixc，ECM)中的各種蛋白成分，破壞腫瘤細胞侵襲的組織學屏障，在腫瘤侵襲轉移中起關鍵作用[21]。本實驗結果發現動脈注射降低VEGF、Bcl-2、MMP-2蛋白表達及升高P21蛋白表達的作用較靜脈注射更顯著。同時，BVZ較CDDP的作用更顯著。

綜上所述，應用BVZ動脈超選化療，能有效控制腦膠質瘤的生長，并且對腦膠質瘤異常的血管生成、細胞周期、細胞凋亡以及侵襲遷移等過程都可能產生影響，從而達到較好的治療效果。目前膠質瘤的治療仍是世界公認的難題，為了延長膠質瘤患者的生存期以及生活質量，醫務工作者在不斷的探索新療法。動脈超選化療能有效控制腦膠質瘤的大小，對其深入探討和完善將可為臨床應用提供一個有效的治療手段。

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