抗炎寡肽EA—230的固相合成

陳科　李乾　郭添　李晨　楊小琳　趙金禮

【摘 要】目的：本文介紹一種抗炎寡肽EA-230（氨基酸序列為Ala-Gln-Gly-Val）的固相合成方法。實驗在無水體系中以2-氯三苯甲基氯樹脂為載體以Fmoc-保護的氨基酸為原料在DIC/HOBt體系中合成EA-230。目標產物收率高，雜質少，結構經質譜與標準品對照一致。本文的合成方法操作簡單，副產物少，重復性高，適用于批量生產制備。

【關鍵詞】EA-230；寡肽；2-氯三苯甲基氯樹脂；固相合成

[Abstract] in this paper，an anti-inflammatory oligopeptide （EA-230）is introduced，which is based on 2-CTC resin with a peptide solid phase，and protected Fmoc-amino acid in DIC/HOBt solution. The synthesized target has high yield and purity， and the structure is right by LC-MS with the standard. It is simple and suitable to synthesize the product for much batches with this method and has little impurities.

[Key words] EA-230；oligopeptide；2-CTC resin；solid phase

【中圖分類號】R979.1 【文獻標識碼】A 【文章編號】2095-6851（2018）01-0-01

寡肽EA-230，又稱AQGV或者NMPF-46或者peptide-46，其氨基酸序列位Ala-Gln-Gly-Val，是一種具有抗炎作用的人絨毛膜促性腺激素相關的寡肽[1]，在膿毒癥和膿毒性休克以及缺血性修復方面有很好的療效[1][2]，正在進行的臨床試驗表明，其在腎衰竭方面的治療具備很好的效果。

日臻成熟并不斷發(fā)展的生物技術與多肽合成技術使得越來越多的多肽藥物被開發(fā)并應用于臨床。多肽藥物因其適應癥廣、安全性高且療效顯著的特點，目前已廣泛應用于腫瘤、肝炎、糖尿病、艾滋病、心腦血管等疾病的預防、診斷和治療，多肽藥物的開發(fā)已經發(fā)展到疾病防治的各個領域，具有廣闊的開發(fā)和應用前景。隨著新藥研發(fā)的不斷深入，目前多肽藥物的開發(fā)已經發(fā)展到疾病防治的各個領域如抗腫瘤、抗病毒、多肽疫苗、細胞因子模擬、抗菌、診斷、減肥等諸多方面。

寡肽是指氨基酸數目在10個左右的小分子多肽，其可以如小分子那樣穿越細胞膜，通過生理屏障，穿過血腦屏障，因而被用作藥物載體來輔助這些藥物穿過細胞膜。同時，一些多肽可以用作非靶向特異性的小分子藥物的靶向載體，通過細胞表面的特定受體將藥物傳遞到受體特異性的特定靶點細胞如腫瘤細胞內。多肽由于其降解后的產物為氨基酸，一般不會在特定器官組織中累積，容易通過肝和腎從體內很快被清除掉，目前幾乎沒有發(fā)現由于異物代謝引起的毒理學等問題，因而，一般沒有副作用或者副作用很小。

大量的生物試驗表明EA-230能有效減輕大鼠同種異體腎移植后急性腎損傷和缺血性損傷[3]，能有效改善因衰退性炎癥和肝損傷（創(chuàng)傷）的出血引起的沖擊和復蘇[4]，減少鼠和恒河猴的膿毒性休克引起的死亡率[2]，對腎缺血再灌注損傷有較好的改善作用[1]，有文獻研究表明其于大鼠的妊娠有關系[5]。由于其在由腎衰竭引起的抗膿毒性休克和出血方面有優(yōu)異的效果，正處于臨床二期。由于其是“人源性肽”，安全性非常高。

目前，國際、國內關于小分子多肽的研究比較多，然而關于寡肽EA-230的合成案例非常少。本文主要介紹一種固相合成寡肽EA-230的方法，以2-氯三苯甲基氯樹脂為載體、以Fmoc保護的氨基酸為原料、按照其氨基酸序列逐個延伸縮合為方法，合成目標肽鏈，將其酸解脫去樹脂可得到目標產物的粗品，然后再對粗品進行鑒定和純化得到最終產品[6]。

一、實驗部分

1.主要的原料和試劑

Fmoc-Ala-OH（吉爾生化上海有限公司）；Fmoc-Gln（trt）-OH（吉爾生化上海有限公司）；Fmoc-Gly-OH（吉爾生化上海有限公司）；Fmoc-Val-OH（吉爾生化上海有限公司）；DMF（分析純，西安浩業(yè)化工有限公司）；DIC（吉爾生化上海有限公司）；HOBt（吉爾生化上海有限公司）；DIEA（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；DCM（分析純，西安浩業(yè)化工有限公司）；異丙醇（分析純，西安浩業(yè)化工有限公司）；哌啶（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；甲醇（分析純，西安浩業(yè)化工有限公司）；2-CTC Resin（天津南開大學樹脂有限公司）。

2.主要儀器

超聲波清洗器（昆山市儀器有限公司 KQ-500B）、循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿有限公司 SHB-Ⅲ）、電子天平（奧豪斯儀器上海有限公司 SE6001F）、制備高效液相色譜儀（創(chuàng)新通恒LC3000）、分析高效液相色譜儀（日立全自動L2000系列）、C18分析色譜柱（大連物理化學研究所4.6mm×250mm）、弱陰離子交換柱（自填體積為150mL 保賽生物科技公司填料 粒徑為45～165μm的DEAE高流速瓊脂糖微球）、C18制備色譜柱（成都科譜生物有限公司50mm×450mm）。

3.試驗方法

（1）樹脂活化將3.0g 2-CTC-Resin樹脂（批號：G55S1133-2 ，交聯度：1%DVB 粒徑：100-200目， 取代度：1.05 mmol/g）加入反應器中，加入50mL DCM，室溫攪拌浸泡5-15分鐘使其充分溶脹活化；

（2）合成Fmoc-Val-2-CTC Resin肽樹脂endprint

在步驟（1）的樹脂中加入Fmoc-Val-OH（1.18g）、DIEA（2.1ml）、DCM 50ml，室溫攪拌反應2小時，抽濾除去溶液，繼續(xù)加入Fmoc-Val-OH（1.07g）、HOBt（0.85g）、DIC（0.98ml）、DMF適量，室溫反應1小時，抽濾除去溶液，樹脂用30ml異丙醇和30ml DMF各進行洗滌兩次，得到FmoFmoc-Val-2-CTC Resin肽樹脂；

（3）將步驟（2）樹脂肽中加入30ml 20%哌啶的DMF溶液，室溫攪拌反應30分鐘。抽濾去除溶液，再用50ml異丙醇和50ml DMF各進行洗滌兩次，得到H-Val-2-CTC Resin肽樹脂，茚三酮檢測顯陽性。

（4）合成Fmoc-Gly-Val-2-CTC Resin肽樹脂

在步驟（3）的樹脂中加入Fmoc-Gly-OH（1.88g，2當量）、HOBt（1.28g，3當量）、DIC（1.47ml，3當量）、DIEA（2.1ml，4當量 ）、DMF100ml，室溫反應2小時，茚三酮檢測顯陰性，抽濾去除溶液，再用50ml異丙醇和50ml DMF各進行洗滌兩次，得到Fmoc-Gly-Val-2-CTC Resin肽樹脂；

（5）將步驟（4）樹脂肽中加入50ml 20%哌啶的DMF溶液，室溫攪拌反應30分鐘。茚三酮檢測顯陽性，抽濾去除溶液，再用50ml異丙醇和50ml DMF各進行洗滌兩次，得到H-Gly-Val-2-CTC Resin肽樹脂。

（6）合成H-Ala-Gln（Trt）-Gly-Val-2-CTC Resin肽樹脂

重復步驟（4）～（5），依次連接Fmoc-Gln（trt）-OH、Fmoc-Ala-OH，得到Ala-Gln（Trt）-Gly-Val-2-CTC Resin肽樹脂；樹脂肽最后用50ml甲醇洗滌三次，干燥得4.5g H-Ala-Gln（Trt）-Gly-Val-2-CTC Resin肽樹脂。

（7）配制30ml樹脂切割液：將三氟乙酸、三異丙基硅烷、水、苯甲硫醚按體積比為88：5：3：4加入到燒杯內攪拌混合；

樹脂切割：將4.5g樹脂加入到上述配置的30ml切割液中，室溫攪拌反應1.5小時，抽濾，濾液控制不高于40℃減壓脫除至基本無餾分，向其中加入30ml甲基叔丁基醚，超聲分散2小時后靜置1小時，過濾，固體用10ml甲基叔丁基醚洗滌，干燥得白色粗品肽1.5g。

二、結果討論

由圖中從分析圖可以看出純度>97%，得到純品1.12g，產率 95.72%。

三、結論

本文介紹了一種固相法合成EA-230的方法，具有操作簡單快捷，純度高，易于分離純化，可重復性高的特點。相較于傳統的液相合成方案，解決了谷氨酰胺溶解性差和不穩(wěn)定的特點，合成時間短，操作步驟少，較大的減少了生產時間和純化成本，為以后批量生產提供了一種行之有效而又簡單便捷的方法。endprint