改良熱硼酸法提取青香蕉果肉總RNA的條件優化

楊昭　何春蘭　李芬芳

摘要：針對青香蕉果肉組織富含多糖、多酚類物質的特點，采用改良熱硼酸法提取青香蕉果肉組織中的總RNA，探討提取緩沖液pH值、離子濃度、CaCl2濃度、處理溫度、處理時間、LiCl沉淀時間對總RNA提取質量的影響，并用異丙醇簡化LiCl沉淀總RNA過程。結果表明，獲得了1種快速提取青香蕉果肉組織中總RNA的方法，經逆轉錄PCR（RT-PCR）驗證，該方法適用于黃香蕉果肉、黃香蕉果皮、香蕉花、青香蕉果肉、青香蕉果皮中總RNA的提取。

關鍵詞：熱硼酸法；青香蕉；異丙醇沉淀；總RNA

中圖分類號： S668.1文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）15-0049-05

香蕉是世界上貿易量很大的水果，被聯合國糧農組織定位為發展中國家的第4大糧食作物[1]，也是我國南方的五大名果之一，是國內重要的消費和出口資源。由于香蕉重要的經濟價值，各國科學家關于香蕉功能基因的研究成為一個熱點。特別是2012年法國科學家領導的國際小組對二倍體香蕉DH-Pahang基因組序列進行了測定[2]，吸引了更多的研究人員關注香蕉功能基因的研究。香蕉組織總RNA的提純是進行香蕉功能基因研究的必要前提，在進行RNA分析、逆轉錄PCR（RT-PCR）、cDNA合成、Northern雜交、cDNA文庫構建、功能基因篩選過程中都需要有高質量、高純度、完整性好的總RNA。

目前已有多篇文獻報道香蕉組織總RNA的提取方法，這些方法主要是十二烷基硫酸鈉（SDS）法[3-8]、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法[9-12]、TRIzol法[13]。這些報道僅研究單一提取方法或對幾種提取方法的提取效果進行比較，并未對影響香蕉組織總RNA提取的關鍵因素進行分析。一旦提取過程中出現RNA純度低、質量差的情況則很難分析其原因。因此，有必要了解在提取過程中影響RNA質量的詳細因素，以便有針對性地解決提取總RNA過程中的問題。

筆者所在課題組在進行香蕉多酚氧化酶基因克隆研究中，須從青香蕉果肉中提取總RNA用于研究。但是青香蕉果肉的硬度、果膠含量、多酚含量均高于成熟香蕉[14-15]，采用RNA提取試劑盒和相關文獻報道的方法，均不能獲得合格的RNA。香蕉組織細胞內的多糖、多酚及色素等次生物質，在RNA提取過程中很難去除干凈[16]。多糖等雜質的存在不僅會使RNA的溶解度降低，還可以抑制許多工具酶的活性，且多酚、色素等物質在提取過程中很容易被氧化而導致RNA變性，影響RNA用于進一步的分子操作，因此，能否在提取過程中盡可能多地去除這些干擾物質是獲得高質量RNA的關鍵[17-19]。

熱硼酸法提取植物組織總RNA已被多次改良，應用于富含多酚的不同作物、組織總RNA的提取[20-21]。但是目前，未有關于熱硼酸法提取青香蕉果肉組織總RNA過程中影響其質量的因素研究。在本研究中，筆者對熱硼酸法提取青香蕉果肉總RNA全過程中的各種影響因子進行了分析，擬摸索出一種既快速又高效地提取青香蕉果肉總RNA的方法，以期為深入開展香蕉功能基因的研究奠定良好的基礎，同時為其他富含多糖、多酚類植物的總RNA提取提供借鑒。

1材料與方法

1.1試驗材料

巴西香蕉果實、花采摘于中國熱帶農業科學院海口實驗站實驗基地（福山實驗基地）。將采收的香蕉花、青香蕉、黃香蕉的果肉、果皮分離后分別用液氮速凍，置于-70 ℃冰箱保存。

1.2試驗儀器

SuperRT cDNA Kit（CW0741），北京康為世紀生物科技有限公司；超微量分光光度計（Nanodrop 2000），美國Thermo公司；PCR儀（Tpersonal 48），德國Biometra公司；凝膠成像系統（G：BOX/EF2），美國Syngene公司；核酸電泳儀（DYCP-31F），北京市六一儀器廠。

1.3香蕉果肉總RNA提取條件優化

1.3.1RNA常規提取方法參照Asif等的方法[12]進行優化。首先將玻璃器皿、鐵勺、研缽等清洗干凈，然后用錫箔紙包裹，于180 ℃烘烤8 h以上，離心管等塑料制品均用0.1% 焦碳酸二乙酯（DEPC）水浸泡過夜，并于121℃高壓滅菌 30 min，60 ℃烘干備用。具體操作如下：

（1）提取緩沖液[2% CTAB，100 mmol/L Tris-硼酸（pH值8.0），1.4 mol/L NaCl，20 mmol/L EDTA（pH值8.0），2% PVP-K30]用前加入β-巰基乙醇至終濃度為2%，將其預熱至60 ℃；（2）果肉用液氮速凍后研磨成粉末，每0.2 g果肉加入1 mL提取緩沖液，渦旋混勻，于60 ℃放置30 min，每隔 5～10 min顛倒混勻1次；（3）將提取液冷卻至室溫，用等體積的三氯甲烷-異戊醇（24 ∶1）抽提，混勻，靜置分層，室溫下于 12 000 r/min 離心5 min；（4）取上清液，加入等體積的三氯甲烷-異戊醇（24 ∶1）抽提，混勻，靜置分層，室溫、12 000 r/min 離心5 min；（5）在上清液中加10 mol/L LiCl至終濃度為 3 mol/L，-20 ℃放置4 h，4 ℃、12 000 r/min離心20 min；（6）小心倒掉上清，沉淀用0.5 mL 3 mol/L LiCl洗滌至少3次；（7）沉淀用0.3 mL DEPC處理水溶解，再用等體積的水飽和酚、三氯甲烷順序抽提；（8）吸取上清液，加入1/15體積的 3 mol/L NaAc（pH值5.2）、1/5體積無水乙醇，冰上放置 0.5 h，4 ℃、12 000 r/min離心20 min，沉淀多糖；（9）在上清液中加入1/10體積3 mol/L NaAc（pH值5.2）、3倍體積無水乙醇，于-70 ℃的冰箱沉淀2 h，4 ℃、12 000 r/min 離心 20 min，沉淀物用0.5 mL 75%乙醇洗滌2次，0.5 mL無水乙醇洗滌1次，每次都于12 000 r/min離心1 min，室溫干燥后溶于RNase-free水中。endprint

1.3.2RNA提取條件優化考察提取緩沖液pH值、離子濃度、CaCl2濃度、處理溫度、處理時間、LiCl沉淀時間對總RNA提取質量的影響，并用異丙醇簡化RNA沉淀過程。

1.3.3RNA質量檢測RNA純度及含量檢測：取1 μL RNA溶液，通過超微量分光光度計檢測得到的RNA含量、D260 nm/280 nm、D260 nm/230 nm值。純RNA D260 nm/280 nm值應為1.8～2.2，D260 nm/230 nm值應為2.0～2.4。RNA回收率計算：RNA回收率（μg/g）=（D260 nm×40×原液體積）/提取樣品質量（g）。

RNA完整性檢測：用1.8%瓊脂糖凝膠檢測。完整的RNA電泳結果應是28S RNA與18S RNA亮度值比約為 2 ∶1，且這2條條帶之間、條帶上方和條帶下方幾乎沒有彌散現象。

1.3.4RT-PCR分析選用NCBI上登錄的香蕉MaActin1（GenBank登錄號：AF285176）片段為內參，設計上、下游引物分別為MaActin1（5′-CGAGGCTCAATCAAAGA-3′）、MaActin2（5′-ACCAGCAAGGTCCAAAC-3′）[22]。RNA逆轉錄合成cDNA第1鏈采用北京康為世紀生物科技有限公司的SuperRT cDNA第1鏈合成試劑盒。

PCR反應體系：12.5 μL 2×ES Master Mix，1 μL MaActin1（10 μmol/L），1 μL MaActin2（10 μmol/L），2 μL cDNA第1鏈，8.5 μL RNase-Free Water。反應程序：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個循環；72 ℃ 5 min。擴增結束后，取5 μL產物，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3.5RNA提取方法驗證將優化的RNA提取方法應用于香蕉花、青香蕉果肉、青香蕉果皮、黃香蕉果肉、黃香蕉果皮5種香蕉組織總RNA的提取，并進行RT-PCR分析。

2結果與分析

2.1緩沖液pH值、離子濃度對RNA提取質量的影響

針對香蕉組織富含酚類物質的特點，采用硼酸緩沖體系的RNA提取液，有利于去除組織中的酚類物質。其中的硼酸可以與酚類化合物依靠氫鍵形成復合物，從而抑制酚類物質的氧化及它們與RNA的結合[23]。由表1可見，Tris-硼酸緩沖液pH值對香蕉果肉RNA質量、得率影響較大；Tris-硼酸緩沖液pH值為6、7、8、9時，D260 nm/280 nm、D260 nm/230 nm值均符合純RNA的D260 nm/280 nm、D260 nm/230 nm值，但RNA的得率差異較大；pH值為9時，得率最高，為18.14 μg/g。圖1顯示，Tris-硼酸緩沖液pH值為8、9時，28S RNA、18S RNA亮度比約為 2 ∶1，完整性較好。因此，選擇緩沖液最優pH值為9。

由表2可見，Tris-硼酸緩沖液離子濃度為100、200、300 mmol/L 時，D260 nm/280 nm、D260 nm/230 nm值均符合純RNA的D260 nm/280 nm、D260 nm/230 nm值；Tris-硼酸緩沖液離子濃度為 100 mmol/L 時，得率最高，為26.97 μg/g。圖2顯示，Tris-硼酸緩沖液離子濃度為100、200、300 mmol/L時，28S RNA、18S RNA 亮度比約為2 ∶1，完整性較好。因此，選擇Tris-硼酸緩沖液離子濃度為100 mmol/L。

2.2CaCl2濃度、處理溫度、處理時間對RNA提取質量的影響

鈣離子在RNA提取過程中可以有效去除組織中的高分子果膠[24]。由表3可見，CaCl2濃度為0、50、100、150、200 mmol/L 時，提取的香蕉果肉RNA的D260 nm/280 nm、D260 nm/230 nm值均符合純RNA的D260 nm/280 nm、D260 nm/230 nm值；不同CaCl2濃度所提取的RNA得率相差很小，當濃度為 150 mmol/L，得率最大，為32.44 μg/g；當不加CaCl2時，得率最低，為21.94 μg/g。圖3顯示，CaCl2濃度為0、100、200 mmol/L 時，28S RNA、18S RNA亮度比約為2 ∶1，完整性最好；CaCl2濃度為50、150 mol/L時，28S RNA ∶18S RNA小于 2 ∶1，完整性不好。綜合考慮，選取CaCl2濃度為 100 mmol/L。

由表4可見，CaCl2加入后放置在0、25、60 ℃，所提取RNA的D260 nm/280 nm、D260 nm/230 nm值均符合純RNA的D260 nm/280 nm、D260 nm/230 nm值；不同放置溫度所提取的RNA得率相差很大，當放置在25 ℃時，得率最大，為20.57 μg/g。圖4顯示，CaCl2加入后放置在25、60 ℃，所提取RNA的28S RNA、18S RNA亮度比約為2 ∶1，完整性較好。所以，選擇CaCl2加入后的放置溫度為25 ℃。

3討論與結論

針對青香蕉果肉組織富含果膠、多酚等次生物質，詳細考察各因素對總RNA提取質量的影響，得出1種快速提取青香蕉果肉總RNA的方法，耗時約4 h，相比于傳統氯化鋰沉淀法（-20 ℃放置4 h或過夜放置），具有快速、操作簡單、總RNA質量高等優點，該方法可用于黃香蕉果肉、黃香蕉果皮、香蕉花、青香蕉果肉、青香蕉果皮中總RNA的提取。從青香蕉果肉組織中提取的總RNA，可應用于香蕉多酚氧化酶的基因克隆研究中，筆者所在課題組已成功獲得香蕉多酚氧化酶的基因[25]。

改良熱硼酸法提取青香蕉果肉總RNA的優化提取方法：提取緩沖液內含2% CTAB、100 mmol/L Tris-硼酸（pH值 9.0）、1.4 mol/L NaCl、20 mmol/L EDTA（pH值8.0）、2% PVP-K30，用前加入β-巰基乙醇至終濃度為2%，將其預熱至60 ℃；組織用液氮速凍后研磨成粉末，每0.2 g果肉加入 1 mL 提取緩沖液，渦旋混勻，于60 ℃放置30 min，每隔5～10 min 顛倒混勻1次；向提取混合液中添加0.5 mol/L CaCl2，使其濃度為100 mmol/L，25 ℃放置20 min；冷至室溫，用等體積的三氯甲烷、異戊醇（24 ∶1）抽提，混勻，靜置分層，室溫、12 000 r/min離心5 min；取上清液，加入等體積的三氯甲烷、異戊醇（24 ∶1）抽提，混勻，靜置分層，室溫、12 000 r/min離心5 min；上清液加入等體積的異丙醇，-20 ℃沉淀20 min，4 ℃、12 000 r/min離心20 min；小心倒掉上清，沉淀用0.5 mL 3mol/L LiCl洗滌至少3次；沉淀用0.3 mL DEPC水溶解，再用等體積的水飽和酚、三氯甲烷順序抽提；吸取上清液，加入1/15體積的3 mol/L NaAc（pH值5.2）、1/5體積無水乙醇，冰上放置0.5 h，4 ℃、12 000 r/min 離心20 min；在上清液中加1/10體積3 mol/L NaAc（pH值5.2）、3倍體積無水乙醇，在-70 ℃冰箱中沉淀2 h，4 ℃、12 000 r/min離心20 min，沉淀物用0.5 mL 75%乙醇洗滌2次、0.5 mL無水乙醇洗滌1次，每次都于 12 000 r/min 離心1 min，室溫干燥后將沉淀溶于RNase-free水中。endprint

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