感染性疾病學、傳染病學

肺炎克雷伯菌攜帶碳青霉烯酶KPC-2的基因環境的多態性研究

沈平華，仉英，蔣曉飛

摘要：目的：KPC（Klebsiella pneumoniaecarbapenemases）是導致肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類耐藥的主要原因，而KPC-2是KPC中最常見的類型之一。中國地區已經報道的關于KPC-2的耐藥基因分別位于肺炎克雷伯菌中的pKP048和pKPHS2質粒上，通過對質粒全基因測序發現了兩種攜帶blaKPC-2的基因環境：pKP048（GenBank accession no：FJ628167.2）的耐藥基因位于一個完整的Tn1721樣轉座子中；pKPHS2（GenBank accession no：CP003224.1）上的基因環境為Tn1721-blaKPC-2-△Tn3-IS26樣的新結構，即Tn1721結構被IS26在Tn3的tnpR處打斷，造成tnpATn3和IRL2Tn1721的丟失。blaKPC-2的基因環境是了解blaKPC-2播散途徑的重要信息，是進行有效的院感控制的基礎。本研究將華山醫院自第一株碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌檢出到該耐藥細菌廣泛播散的這段時期內耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌作為一個完整的樣本，運用PCR及測序獲得攜帶blaKPC-2的完整的基因結構及側翼序列，希望為下一步深入研究該耐藥基因的播散機制提供全面的基因背景。方法：收集華山醫院自2006年8月—2009年12月連續不重復的耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌，共42株。運用引物KPC-FOR：5'-TCGCTAAACTCGAACAGG-3'和KPCREV：5'-TTACTGCCCGTTGACGCCCAATCC-3'，以抽提的質粒為模板，對42株細菌進行blaKPC-2篩選。隨后進行多位點序列分型（MLST）。根據pKP048和pKPHS2的序列，設計了一系列PCR引物進行擴增與測序，分別用于檢測本批菌株中是否存在與上述已經報道的blaKPC-2的基因環境相同的結構。結合后續的crossing PCR可以覆蓋整個基因環境的序列。PCR陽性產物送上海邁浦生物科技有限公司純化后測序。根據Junction PCR與Mapping PCR的結果，當出現區別與以上兩種結構的新結構時，擬運用代表性質粒測序及以純質粒為模板進行PCR walking等方法，獲得整個新結構的完整基因環境的序列。結果：42株肺炎克雷伯菌MLST分型顯示：5株屬于ST423，2株屬于ST65，1株屬于ST977，34株均屬于ST11型。展示了所有菌株攜帶blaKPC-2的基因結構及該結構兩側的序列。本批菌株檢測到了與pKP048和pKPHS2不同的blaKPC-2的基因環境。A型為Tn1721-blaKPC-2-Tn3樣結構，顯示具備與pKP048相似的blaKPC-2的基因環境，但該機構上下游序列分別為parA基因和DNA distortion protein 3-like基因，而不是Tn1721的IRL2。A型結構，分別位于ST423、ST65、ST97型菌株中。B結構的質粒均位于ST11型菌株中。B1型顯示具有與pKPHS2相同的blaKPC-2的基因環境，即Tn1721-blaKPC-2-△Tn3-IS26。且該結構外圍也具備相同的基因結構。B2型與B1型相比唯一的區別是J1陰性，以純質粒為模板，運用引物2R向一側Walking。該型Tn1721的IRR上游序列與K.pneumoniaJM45 plasmid p2（GenBank accession no：CP006658.1）上的一個功能未知的蛋白序列高度一致，與△IS26無相似性。B2與B1結構中IS26的下游均連接著TniA基因。結論：華山醫院自碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌爆發初期，即存在blaKPC-2基因環境的多態性，提示其blaKPC-2播散可能存在不同的來源。尤其B1與B2存在不同的側翼序列，推測該結構是一種新型的嵌合型可移動元件，可能具備水平轉移的能力，轉移過程中發生了不同位置的插入。本文在研究方法上也有一定的創新。克服了運用全質粒測序后獲得攜帶blaKPC-2基因環境費時費力及難以進行大樣本分析的弊端；同時以往的研究中，通常只是分析blaKPC-2上下游的一小段序列，完整展示了攜帶blaKPC-2基因環境，為進一步分析該結構可能的移動模式和機制提供了有價值的基因背景。鑒于本文的局限性，下一步擬在菌株收集的時間和種類上進一步擴展，以獲得華山醫院耐碳青霉烯類腸桿菌科細菌攜帶blaKPC-2的基因環境，為控制醫院感染提供有價值的信息。總之，華山醫院耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌的主要流行株為ST11型，且臨床數據顯示攜帶耐藥基因blaKPC-2的基因環境存在多態性，提出該耐藥基因的水平播散可能存在不同的機制，為下一步研究該耐藥基因的水平播散模式和機制奠定了研究基礎。

來源出版物：中國感染與化療雜志, 2016, 16(6): 680-684

入選年份：2016

發熱門診血流感染154例病原學分析

李曉光，胥婕，姚貝

摘要：目的：通過分析發熱門診血流感染患者常見病原菌的分布和藥敏情況，為社區獲得性血流感染（BSI）的經驗性治療提供依據。方法：通過檢索北京大學第三醫院檢驗系統中2009年1月—2013年12月發熱門診的血培養化驗單，對血培養陽性結果逐一人工查閱病歷。對臨床考慮為一次感染過程中多次血培養陽性且為同一細菌者只收錄首次血培養結果，對于同一患者血培養為多種細菌者，分析為致病菌或污染菌的可能性后再納入。血流感染的診斷標準參照《2001年中華人民共和國衛生部醫院感染診斷標準（試行）》。污染菌的判定參考美國CDC 1996年醫院感染診斷標準，常見的皮膚寄殖菌如類白喉桿菌、桿菌屬、丙酸桿菌屬、凝固酶陰性葡萄球菌、微球菌考慮污染菌可能。對于凝固酶陰性葡萄球菌，如果在培養72 h以上報警或者單次培養陽性者不計入統計。最終154例患者納入研究，分析其病原學特點。結果：2009年1月—2013年12月發熱門診就診患者中1267例行血培養檢查，166例患者培養出菌株177株，9株為重復培養，1例患者同時培養出大腸埃希菌和表皮葡萄球菌，1例患者同時培養出大腸埃希菌和芽孢桿菌，考慮表皮葡萄球菌和芽孢桿菌為污染菌。結合血培養報警時間大于72 h和培養出的菌種，另確定12株污染菌，包括葡萄球菌、棒狀桿菌、芽孢桿菌，故實際納入研究菌株154株（12.2%，154/1267）。154例患者中，男80例（51.9%），女74例（48.1%）。患者的平均年齡（57±20）歲，65歲以上為老年組有68例（44.2%，68/154）。與中青年組比較，老年組患者中男性比例更高，差異有統計學意義（χ2＝4.701，P＝0.030）。有明確感染灶者68.2%，主要為肺部感染、急性腎盂腎炎、腸道感染、膽道感染、腹腔感染、肝膿腫等，多部位感染10例（6.0%）。血培養結果最終納入研究病原菌154株，其中革蘭陰性菌127株（82.5%），革蘭陽性菌27株（17.5%）。革蘭陰性菌的報警時間（time to positivity）：需氧培養（13.8±15.6）h，厭氧培養（13.3±16.2）h；革蘭陽性菌的報警時間：需氧培養（16.9±9.5）h，厭氧培養（17.6±18.9）h；2種菌的報警時間差異無統計學意義（P＞0.05）。大腸埃希菌的報警時間，需氧培養（14.9±14.3）h，厭氧培養（15.6±17.7）h。檢出病原菌第一位是大腸埃希菌82株（53.3%），其次是肺炎克雷伯菌19株（12.3%）、沙門菌屬15株（9.7%）、鏈球菌屬13株（8.4%）、凝固酶陰性葡萄球菌8株（5.2%）。大腸埃希菌對碳青霉烯類藥物敏感率100%，對哌拉西林-他唑巴坦、頭孢哌酮-舒巴坦的敏感率80%以上，對頭孢他啶、頭孢吡肟、氨曲南的敏感率在60%～79%，對頭孢呋辛、頭孢曲松、左氧氟沙星的敏感率50%～60%。分析臨床經驗治療，病原菌對首選藥物89.2%呈現敏感。結論：發熱門診社區獲得性血流感染患者病原菌種類多樣，以革蘭陰性菌為主，第一位是大腸埃希菌；對多數患者而言，第三代頭孢菌素、喹諾酮類藥物經驗治療有效。

來源出版物：中國感染與化療雜志, 2016, 16(2): 123-128

入選年份：2016