一種快速提取土壤微生物DNA的方法

陶興玲

(長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025)

雷瓊

(湖北省荊州文物保護(hù)中心，湖北 荊州 434020)

馬立安

(長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025)

土壤微生物資源豐富，每克土壤含有大約107個原核生物細(xì)胞，但用傳統(tǒng)的技術(shù)培養(yǎng)的微生物僅占微生物總數(shù)的0.01%～10%[1]，而大部分的微生物處于不可培養(yǎng)的狀態(tài)，相當(dāng)多的菌種由于無法培養(yǎng)使之不能被充分地開發(fā)和利用，因此從自然環(huán)境中提取微生物的DNA 對不可培養(yǎng)細(xì)菌的檢測、某些目標(biāo)菌株的跟蹤或重組基因在自然條件下的行為有重要的意義[2～5]。

自20世紀(jì)70年代開始，研究者就開始關(guān)注土壤微生物DNA的提取方法。目前土壤微生物DNA的提取方法主要有直接法[6]和間接法[7,8]。采用間接法提取的DNA純度比較高，但提取量很少；采用直接法獲得的DNA量大并且能代表大部分的土著微生物種群，但是純度較低。純化是一件繁瑣的事情，目前純化的方法有氯化銫密度梯度超速離心法、PVPP(聚乙烯基吡咯烷酮)法、色譜法、電泳法、試劑盒、透析和過濾法等[9]，但這些純化方法往往造成核酸的大量損失。陳旭玉等[10]介紹的方法不僅可以獲得大片段，并且不需要純化即可直接用于PCR擴(kuò)增和DNA酶切等后續(xù)操作，每克土壤DNA提取量約為2.1～4.6μg，但是此方法耗費(fèi)時間長、較繁瑣。本研究在陳旭玉等[10]的方法基礎(chǔ)上，對該方法的SDS裂解細(xì)胞溫育時間、PEG沉淀DNA時間、CTAB溶解DNA沉淀溫育時間、異丙醇沉淀DNA放置時間、SDS裂解細(xì)胞離心條件以及異硫氰酸胍試劑的加入與否等實驗條件進(jìn)行了優(yōu)化，旨在建立一種經(jīng)濟(jì)、快速、簡單的土壤微生物DNA提取方法。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品

土壤樣品分為2種：一種采自潛江某油田作業(yè)油井及廢棄老井附近，共采集7個土樣，分別記為：1#、2#、3#、4#、5#、6#、7#；另一種是采自長江大學(xué)西校區(qū)農(nóng)學(xué)院實驗基地：麥田、草地、大豆田、玉米田、水稻田、樹林、生活淤泥。土樣采集深度為地表20～25cm，所有樣品無菌密閉保存于4℃冰箱中。

1.2 試劑

主要試劑有十二烷基硫酸鈉(SDS)、乙二胺四乙酸(EDTA)、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、異硫氰酸胍,均為分析純級。

1.3 土壤微生物DNA提取方法

原方法：參照陳旭玉等[10]報道的方法。

優(yōu)化后的方法：(1)SDS裂解土壤微生物細(xì)胞：稱取10g土壤于50mL離心管，加18.5mL SDS裂解液(0.25mol/L NaCl，0.1mol/L EDTA，4% SDS)，渦旋1.5min，68℃溫育20min，每10min輕輕搖動，7000r/min離心10min，將上清液移入50mL干凈的離心管。(2)PET沉淀DNA去除雜質(zhì)：加0.125倍體積的5mol/L醋酸鉀和0.42倍40% PEG-8000，6000r/min離心15min。(3)CTAB溶解DNA沉淀：加18mL 2×CTAB(2% CTAB，1.4mol/L NaCl，0.1mol/L MEDTA)中溶解沉淀，68℃溫育5min。(4)去除蛋白質(zhì)：加等體積的苯酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)，輕柔混勻，6000r/min離心10min。(5)異丙醇沉淀DNA：在DNA上清液中加0.6～1.0倍體積的異丙醇，13000r/min離心20min。(6)70%的酒精洗滌DNA沉淀：用70%的酒精洗2～3次，自然晾干，加500μL TE緩沖液或無菌水。

1.4 提取方法的優(yōu)化

優(yōu)化其中一個條件的時候，其他實驗條件參照陳旭玉等[10]的方法，逐條優(yōu)化。實驗過程中，在進(jìn)行各項條件優(yōu)化以及后續(xù)穩(wěn)定性和可操作性實驗時，均用麥田土壤。

細(xì)胞裂解優(yōu)化內(nèi)容為：SDS裂解細(xì)胞溫育時間分別設(shè)置15、20、25、30、45、60min 6個不同時間段；SDS裂解細(xì)胞離心條件分別設(shè)置7000r/min 10min、8000r/min 10min、9000r/min 10min、6000r/min 15min 4種不同條件；異硫氰酸胍的加入與否設(shè)置加入與不加入2種條件。

DNA提取優(yōu)化內(nèi)容為：PEG沉淀DNA時間分別設(shè)置0、5、10、15min 4個不同時間段；CTAB溶解DNA沉淀溫育時間分別設(shè)置5、8、11、14min 4個不同時間段；異丙醇沉淀DNA放置時間分別設(shè)置0、15、30、45、60、180min 6個不同時間段。

1.5 優(yōu)化提取方法的穩(wěn)定性研究

采取2種重復(fù)方式進(jìn)行實驗,一種是取同一種樣品在3個不同時間操作，每次3個重復(fù)。另一種是取同一樣品進(jìn)行5個重復(fù)操作。

1.6 優(yōu)化提取方法的應(yīng)用性研究

采取不同土質(zhì)的土壤樣品分別進(jìn)行實驗，一種采自潛江某油田作業(yè)油井及廢棄老井附近的7個土壤樣品，另一種是采自長江大學(xué)西校區(qū)農(nóng)學(xué)院實驗基地的7個土壤樣品，每個樣品2次重復(fù)。

1.7 優(yōu)化提取方法的可操作性研究

3人同時操作，每人重復(fù)3個樣品。

1:15min；2:20min；3:25min；4:30min；5:45min；6:60min圖1 不同SDS裂解細(xì)胞溫育時間下的DNA瓊脂糖凝膠電泳圖

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤微生物DNA提取方法的優(yōu)化

2.1.1 細(xì)胞裂解優(yōu)化結(jié)果

采用6個不同時間段進(jìn)行SDS裂解細(xì)胞溫育時間優(yōu)化，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，采用溫育20min 即可達(dá)到所需要求，故可將SDS裂解細(xì)胞溫育時間從1h縮短至20min。

采用4種不同條件進(jìn)行SDS裂解細(xì)胞離心條件優(yōu)化，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，采用7000r/min 10min、8000r/min 10min 均可達(dá)到所需要求，最終選擇7000r/min 10min，以通過提高轉(zhuǎn)速縮短離心時間，從而縮短試驗時間。

1：7000r/min10min；2：8000r/min10min；3：9000r/min10min；4：6000r/min15min圖2 不同SDS裂解細(xì)胞離心條件下的DNA瓊脂糖凝膠電泳圖1：加入異硫氰酸胍；2：不加入異硫氰酸胍圖3 加入與不加入異硫氰酸胍下的DNA瓊脂糖凝膠電泳圖

采用加入與不加入異硫氰酸胍2種條件進(jìn)行比較，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，不加入異硫氰酸胍試劑對提取結(jié)果影響不明顯，因此優(yōu)化的實驗方法不加入異硫氰酸胍，可使該實驗方法更經(jīng)濟(jì)。

2.1.2 DNA提取優(yōu)化結(jié)果

采用4個不同時間段進(jìn)行PEG沉淀DNA時間優(yōu)化，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，采用0 min 即可達(dá)到所需要求，故可將PEG沉淀DNA這一步驟省去，以縮短試驗時間。

采用4個不同時間段進(jìn)行CTAB溶解DNA沉淀溫育時間優(yōu)化，結(jié)果如圖5所示。由圖5可知，采用5min 即可達(dá)到所需要求，故可將CTAB溶解DNA沉淀溫育時間從15min 縮短至5min。

采用6個不同時間段進(jìn)行異丙醇沉淀DNA放置時間優(yōu)化，結(jié)果如圖6所示。由圖6可知，采用放置0 min 對提取結(jié)果影響不明顯，故可將異丙醇沉淀DNA這一步驟省去，以縮短試驗時間。

1：0min；2：5min；3：10min；4：15min圖4 不同PEG沉淀DNA時間下的DNA瓊脂糖凝膠電泳圖1：5min；2：8min；3：11min；4：14min圖5 不同CTAB溶解DNA沉淀溫育時間下的DNA瓊脂糖凝膠電泳圖1：0min；2：15min；3：30min4：45min；5：60min；6：180min圖6 不同異丙醇沉淀DNA放置時間下的DNA瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2 優(yōu)化提取方法的穩(wěn)定性

采取2種重復(fù)方式進(jìn)行研究，結(jié)果如圖7所示。由圖7可知，同一樣品3個不同時間的3個重復(fù)中，條帶8的提取量較差；同一樣品的5個重復(fù)中，條帶11的提取效果不佳，其余條帶提取效果均較好，由此可知該方法具有一定穩(wěn)定性。

2.3 優(yōu)化提取方法的應(yīng)用性

采取不同土質(zhì)的土壤樣品分別進(jìn)行實驗，結(jié)果如圖8所示。由圖8a可知，5#和6#土樣的提取效果較好，其他編號的土樣提取效果一般，但都有提取量，可能由于不同土壤樣品中微生物含量有差異，從而導(dǎo)致提取量不同。由圖8b可知，草地、玉米田、水稻田和生活淤泥的提取效果更好，小麥田、樹林等都有提取量。根據(jù)不同土壤樣品的實驗結(jié)果可知，優(yōu)化的實驗方案適用于不同地質(zhì)土壤樣品DNA的提取。

2.4 優(yōu)化提取方法的可操作性

優(yōu)化提取方法的可操作性研究結(jié)果如圖9所示。由圖9可知，3人提取的3個樣品中，均有2個樣品提取效果較好，可見該實驗方案對于不同的人員均具有一定的可操作性。

1～3：第1次3的個重復(fù)；4～6：第2次的3個重復(fù)；7～9：第3次的3個重復(fù)；10～14：同一次的5個重復(fù)。圖7 穩(wěn)定性DNA瓊脂糖凝膠電泳圖

a.油井附近土壤樣品1～2：1#；3～4：2#；5～6：3#；7～8：4#；9～10：5#；11～12：6#；13～14：7#

b.實驗基地土壤樣品1～2：麥田；3～4：草地；5～6：大豆田；7～8：玉米田；9～10：水稻田；11～12：樹林；13～14：生活淤泥圖8 不同土質(zhì)的土壤樣品的DNA瓊脂凝膠電泳圖

1～3：分別為同一人；4～6：分別為同一人；7～9：分別為同一人。圖9 不同人員操作提取的DNA瓊脂糖凝膠電泳圖

2.5 2種土壤微生物DNA提取方法的比較

通過對陳旭玉等[10]報道的方法進(jìn)行單因素實驗，得出了優(yōu)化后的實驗方法。由表1可知，優(yōu)化后方法和原方法相比，實驗時間縮短了250 min，省去了異硫氰酸胍試劑。

表1 2種方法優(yōu)化內(nèi)容與結(jié)果比較

3 討論與結(jié)論

本研究優(yōu)化了陳旭玉等[10]的方法，優(yōu)化后的土壤微生物DNA提取方法，其穩(wěn)定性、適用性和可操作性均達(dá)到滿意的結(jié)果。但是判斷該方法的優(yōu)化結(jié)果時，單一地從DNA條帶的亮暗來評判，只是定性研究并沒有定量試驗。后續(xù)研究中，如果能夠從DNA的提取量、純度等方面進(jìn)行試驗驗證，通過定量研究，優(yōu)化的結(jié)果將得到更細(xì)致的描述。

優(yōu)化后的方法與原方法相比，實驗時間縮短了250min，省去了異硫氰酸胍試劑。因此，優(yōu)化后方法是一種經(jīng)濟(jì)、快速、簡單的土壤微生物DNA提取方法。

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[編輯] 余文斌