蒙藥黃連—4湯對心肌缺血再灌注損傷SD大鼠cTn—I、CK、LDH的保護(hù)作用

金哈布日+李平+張青山+布仁巴圖

【摘要】目的 探討蒙藥黃連-4湯對大鼠心肌缺血再灌注損傷中cTn-I、CK、LDH的影響。方法 取健康雄性SD大鼠共60只，分為六組：假手術(shù)組、心肌缺血再灌注損傷模型組、蒙藥黃連-4湯低劑量組、蒙藥黃連-4湯中劑量組、蒙藥黃連-4湯高劑量組、丹參組，治療組連續(xù)灌胃給藥15天后，采用結(jié)扎大鼠左冠狀動脈下降支的方法制備心肌缺血再灌注損傷的模型，心肌缺血30 min，再灌注90 min。假手術(shù)組大鼠只穿線不結(jié)扎左冠狀動脈下降支。心肌缺血再灌注末立即行腹主動脈取血。通過酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）法檢測血清中磷酸肌酸激酶（CK）、乳酸脫氫酶（LDH）、肌鈣蛋白（cTn-I）水平。結(jié)果 蒙藥黃連-4湯組血清CK、LDH、cTn-I水平顯著性降低。結(jié)論 蒙藥黃連-4味湯對心肌缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用。其作用機(jī)制與心肌酶CK、LDH、cTn-I含量有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】蒙藥黃連-4湯；心肌缺血再灌注損傷；CK；LDH；cTn-I

【中圖分類號】R542.2 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】B 【文章編號】ISSN.2095-6681.2017.33..03

當(dāng)前，隨著社會不斷發(fā)展，物質(zhì)水平的高速提高，不健康的飲食習(xí)慣、大量的吸煙和飲酒、長期缺乏運(yùn)動以及精神上的壓力使我國心血管疾病的發(fā)病率不斷攀升[1]。研究發(fā)現(xiàn)，心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia reperfusion injuty ，MIRI）是一種心肌缺血后加重原有的損傷，引起心肌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)及功能發(fā)生不可逆性改變，進(jìn)而加重原有的心血管病，最終導(dǎo)致患者病情惡化甚至死亡的疾病[2]。蒙藥黃連-4湯是蒙醫(yī)傳統(tǒng)方劑之一，是由黃連、梔子、瞿麥、多葉棘豆組成，具有清熱解毒、防止燥濁熱、調(diào)理赫依齊素相搏之功效。君藥黃連的性質(zhì)為苦、寒、無毒，具有清熱燥濕，瀉火解毒、調(diào)理體素、瀉火除煩、改善心臟赫依、齊素循環(huán)，調(diào)節(jié)免疫功能、改善心血管功能、降血壓、抗血小板等功效，在這一基礎(chǔ)上加以辨證施治。本實(shí)驗(yàn)通過研究蒙藥黃連-4湯對大鼠心肌再灌注損傷后心肌酶及肌鈣蛋白I的變化，進(jìn)一步探討蒙藥黃連-4湯的應(yīng)用對心肌再灌注損傷大鼠心臟的保護(hù)作用機(jī)制。報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

試驗(yàn)動物：選用清潔級雄性SD大鼠60只，體重約（280±20）g，大鼠飼養(yǎng)于適宜溫度和濕度的動物室中，相同飼養(yǎng)環(huán)境且自由飲食，自然晝夜（術(shù)前12 h禁食水）。（由遼寧長生生物技術(shù)有限公司提供，許可證號碼為：SCXK（遼）2015-0001）。

主要試劑及使用藥品：蒙藥黃連-4湯（由內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院制劑室生產(chǎn)制劑）；丹參片（南京厚生藥業(yè)有限公司生產(chǎn)）；磷酸肌酸激酶（CK）試劑盒（SOOOO-96T）；乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒（SOOOO-96T）；肌鈣蛋白（cTn-I）試劑盒（SOOOO-96T）；水合氯醛（天津市天力化學(xué)試劑有限公司）。

主要儀器：電熱恒溫培養(yǎng)箱（BDR-82，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；心電圖機(jī)（成都泰盟軟件有限公司）；HX-300S動物呼吸機(jī)（成都泰盟軟件有限公司）；BL-420S生物技能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)（成都泰盟軟件有限公司）。全自動多功能酶標(biāo)儀（MULTISKANMK3，wELLWASH4MKZ芬蘭）；低速自動平衡離心機(jī)（北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動物分組及給藥方法

60只正常成年雄性SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，正常飲食，體重約（280±20）g，每組10只隨機(jī)分成6組：假手術(shù)組、模型組、黃連-4湯底劑量組、黃連-4湯中劑量組、黃連-4湯高劑量組、丹參組。假手術(shù)組和模型組灌胃等容積生理鹽水，黃連-4湯成人（60KG）劑量為3 g/kg·d，低、中、高劑量組分別于成人的6、12、18倍（0.04 g/kg·d、0.08g/kg·d、0.16 g/kg·d），陽性對照組給予丹參0.04 g/kg·d，各組灌胃每天1次，灌胃15天。

1.2.2 心肌缺血再灌注損傷模型建立

按文獻(xiàn)[3]方法加以改進(jìn)后進(jìn)行造模。術(shù)前15分鐘大鼠用10%水合氯醛（300mg·kg-1）腹腔注射麻醉，大鼠麻醉成功后仰臥位固定，大鼠頭部上仰，在氣管處剪毛后切開頸部暴露，剝離甲狀腺切開氣管，置氣管套管連接小動物呼吸機(jī)，正壓通氣（呼吸頻率70～80次/min，呼吸比3：2，潮氣量0.002～0.003 L），大鼠四肢皮下插入電極，連接BL-420S生物技能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，持續(xù)記錄Ⅱ?qū)?lián)的心電圖。大鼠胸部剪毛后在胸骨左緣橫向切開皮膚，沿著第3、4肋間逐層打開胸腔，暴露心臟，用6-0無損傷真絲線于左心耳下約2～3 mm處，穿過心臟表層結(jié)扎左冠狀動脈前降支（深度約1.5 mm），致心肌缺血30 min拆線后再灌注90 min。假手術(shù)組只穿線不予結(jié)扎處理。心肌缺血時(shí)肉眼可看到局部心臟肌肉組織蒼白或發(fā)紺，以Ⅱ?qū)?lián)心電圖ST段太高或者T波異常，心肌再灌注損傷時(shí)缺血區(qū)心肌組織轉(zhuǎn)紅，太高的ST段降低50%以上可判斷為心肌缺血模型

成功。

1.2.3 生化指標(biāo)檢測

各組大鼠均再灌注90 min后，腹主動脈取血（約

3 mL），離心15 min（3000 r·min-1，4℃），取上清放入-80℃冰箱凍存?zhèn)溆茫瑴y定血清LDH、CK、cTn-I等生化指標(biāo)，具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件對本次數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，計(jì)數(shù)資料以例（n），百分?jǐn)?shù)（%）表示，采用x2檢驗(yàn)，計(jì)量資料以“x±s”表示，采用t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 蒙藥黃連-4湯對大鼠MIRI血清LDH水平的影響endprint

與假手術(shù)組相比較：模型組血清LDH的水平顯著性升高（P<0.05）；與模型組相比較：黃連-4湯各劑量組均使血清LDH水平降低，以黃連-4湯高劑量組最為顯著（P<0.05）；與丹參組相比較：黃連-4湯高劑量組血清LDH產(chǎn)生顯著性差異（P<0.05）。見表1。

2.2 蒙藥黃連-4湯對大鼠MIRI血清CK水平的影響

與假手術(shù)組相比較：模型組血清CK的水平顯著性升高（P<0.05）；與模型組相比較：黃連-4湯各劑量組均使血清CK水平降低，以黃連-4湯高劑量組最為顯著（P<0.05）；與丹參組相比較：黃連-4湯高劑量組血清CK產(chǎn)生顯著性差異（P<0.05）。見表1。

2.3 蒙藥黃連-4湯對大鼠MIRI血清肌鈣蛋白cTn-I水平的影響

與假手術(shù)組相比較：模型組血清cTn-I的水平顯著性升高（P<0.05）；與模型組相比較：黃連-4湯各劑量組均使血清cTn-I水平降低，以黃連-4湯高劑量組最為顯著P<0.05）；與丹參組相比較：黃連-4湯高劑量組血清cTn-I產(chǎn)生顯著性差異（P<0.05）。見表1。

3 討 論

心臟作為機(jī)體的發(fā)動機(jī)，其自身組織結(jié)構(gòu)和生理功能的完整性時(shí)時(shí)刻刻影響著機(jī)體生老病死過程中的每一分鐘。因此預(yù)防和治療冠狀動脈血流再灌注后造成的損傷與心肌梗死的研究愈來愈受到廣大學(xué)者們的關(guān)注。大量研究顯示，MIRI會進(jìn)一步加大心肌缺血及心功能障礙的程度，甚至比急性心肌梗死嚴(yán)重，且病死率高[4]。前期研究發(fā)現(xiàn)MIRI的發(fā)生機(jī)制包括再灌注性心肌酶、肌鈣蛋白漏出增

多[5-6]，心肌再灌注損傷時(shí)心肌細(xì)胞膜通透性增加，從而使心肌中數(shù)量較多的CK、LDH等心肌酶大量漏入到血液當(dāng)中，使血清中CK、LDH的濃度升高[7]。本次實(shí)驗(yàn)中大鼠血清CK指標(biāo)檢測結(jié)果表明，MIRI模型組的CK值比較高，與假手術(shù)組和藥物組比較后具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。蒙藥黃連-4湯組大鼠血清中的 CK值比模型組較低，說明蒙藥黃連-4湯能有效地抑制ATP和肌酸之間的轉(zhuǎn)磷酰基反應(yīng)，延緩或減輕心肌細(xì)胞中肌酸激酶的漏出目前認(rèn)為在心梗時(shí)測定CK的活性比做心電圖更有臨床價(jià)值[8-9]。LDH作為一種糖酵解酶[10]，半壽期是10-163 h，在臨床上多用于回顧性診斷，本次實(shí)驗(yàn)中大鼠血清LDH指標(biāo)檢測結(jié)果表明，大鼠MIRI模型組中 LDH的活性顯著升高，說明心肌細(xì)胞損傷時(shí)漏出的LDH增多，而蒙藥黃連-4湯組中的LDH活性低于模型組，說明蒙藥黃連-4湯有效地抑制心肌細(xì)胞內(nèi)LDH的漏出，其抑制途徑可能與調(diào)控心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平相關(guān)。現(xiàn)認(rèn)為cTnI為心肌中具有高度特異性的小分子量蛋白，當(dāng)心肌受損時(shí)能夠更早并且更易漏出入血液當(dāng)中，而且在血液中維持的時(shí)間也較長，因cTnI具有高度的靈敏性和特異性，所以心肌缺血再灌注后檢測血液中cTnI的含量可作為心肌損傷的重要指標(biāo)[6]。并且cTn-I在血清中的含量極其微少，且具有基因編碼的特異性[11]，本次實(shí)驗(yàn)中黃連-4湯組大鼠血清中cTn-I含量低于MIRI模型組（P<0.01），說明黃連-4湯組能有效減輕心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞及壞死程度，從而使cTn-I釋放入血的量明顯降低，為缺血再灌注損傷的心肌細(xì)胞功能的修復(fù)起到一定的有效作用。

眾所周知，傳統(tǒng)蒙藥在治療各不同類心血管疾病中有其獨(dú)特的優(yōu)勢。除君藥黃連之外，主要成分梔子具有瀉火除煩，清熱利尿，涼血散瘀作用，瞿麥有利尿通淋，破血通經(jīng)作用，多葉棘豆有殺"粘"蟲，清熱，燥"希日烏素"，愈傷，生肌，止血，消腫，通便等作用。因此蒙藥黃連-4湯能夠抑制心肌缺血再灌注損傷CK、LDH、cTn-I的水平從而達(dá)到大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。而本實(shí)驗(yàn)研究是首次對蒙藥黃連-4湯在心肌缺再灌注方面血進(jìn)行了藥效學(xué)研究，增加并明確了蒙藥黃連-4湯在心肌缺血再灌注損傷方面的臨床主治范圍，在臨床上增加了治療心肌缺血再灌注損傷的用藥選擇。

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本文編輯：李 豆endprint