外泌體在中醫證候研究中的應用※

焦海燕 嚴志祎 劉玥蕓 姜幼明

（北京中醫藥大學中醫學院，北京 100029）

中醫證候的研究一直是現代中醫學研究的重點，隨著證候研究與多學科的交叉，以及新的研究方法和理念的引入，證候研究水平不斷深化，研究層次也得到了拓寬。由于證候的復雜性、模糊性、動態性等特點，證候理論的客觀化以及證候診斷標準與機制的研究仍是現階段中醫證候研究的重點內容。近年來，細胞分泌的胞外小囊泡在生物體內發揮的作用被逐步發掘，受到越來越多研究者們的關注。細胞外囊泡包括微泡 (microvesicle)、外泌體 (exosomes)、微球 (microparticle)以及凋亡小體 (apoptotic body)，這些成分各異的囊泡體均能介導細胞間的信息交換和物質傳遞，而外泌體是其中功能較為突出的一類小囊泡[1]。外泌體作為胞外活性囊泡體，能夠參與細胞間的信號傳遞，其中所包含的大量活性物質參與機體各項生理活動，對相應組織細胞產生的外泌體進行研究能夠從微環境的角度揭示細胞間通訊促進某一疾病發生的機制與物質基礎。此外，外泌體中也包含了疾病狀態下細胞的分子信息，因而含有豐富的生物標志物分子源，可用于疾病的診斷。因此，將外泌體引入中醫證候的研究，能夠有效拓展證候研究的思路，促進微觀辨證的發展，為中醫證候的客觀化提供物質基礎。

1 外泌體的生物學特征

外泌體于1987年首次發現于網織紅細胞的培養液中，在之后的研究中發現神經細胞、成纖維細胞、淋巴細胞、白細胞、樹突狀細胞、肥大細胞、腫瘤細胞等多種細胞均能分泌和釋放外泌體，使其廣泛存在于外周血、組織、細胞間隙以及各種體液中[2]。隨后，有研究發現B淋巴細胞釋放的外泌體能夠刺激T細胞活化、增殖，誘導免疫反應，改變細胞外微環境，從而抑制腫瘤細胞生長，這使研究者們認識到外泌體不僅是細胞的代謝產物，其在機體生命活動中也發揮著重要的作用[3]。

在作用機制方面，外泌體與微泡并沒有太大的區分，它們均是為了細胞間的相互作用而被釋放到胞外，包含細胞釋放的核酸、蛋白、脂質等分子，在與受體細胞結合后介導胞內信號轉導，改變受體細胞的功能。外泌體與微泡的主要區別在于形成方式不同，外泌體是由胞內內溶酶體微粒 (endolysosomal vesicle)形成的多囊泡體 (multi-vesicular body)與細胞膜融合后向胞外分泌的小囊泡，其大小均一，直徑在40～150 nm，不同細胞釋放的外泌體表面均有相似的保守蛋白標志物，如CD9、CD63、CD81、Alix等，與其來源細胞相關的特異性物質包含在囊泡內，使不同源的外泌體具有相應的生物學功能[4]，另外大量研究表明，各類進化保守蛋白對不同來源的外泌體的形成與釋放具有一定的作用，如微管蛋白和肌動蛋白參與了外泌體的形成過程，磷脂酶D2影響外泌體的釋放，HSP70有助于外泌體適應感染、缺氧、細胞因子刺激等不利的細胞外環境，同時也能使外泌體激活免疫系統消滅病變細胞，CD55與CD59則可以保護外泌體免受機體的免疫攻擊[5]；微泡則是由細胞出芽后，與細胞膜融合直接脫落而形成的囊泡，大小不一，直徑約在50 nm～1000 nm，目前研究尚未明確微泡是否具有表面標志蛋白，其膜脂質成分、蛋白組成等也還需進一步的探索[6]。

外泌體與靶細胞的識別具有特異性，其介導細胞信號傳遞的方式主要有以下四種[7]：一是直接作用于靶細胞表面的特異性受體，如T淋巴細胞源的外泌體可通過磷脂酰絲氨酸特異性識別單核細胞膜表面的受體，從而誘導膽固醇堆積，這一過程可被抗磷脂酰絲氨酸受體的抗體抑制[8]；二是被靶細胞攝入，釋放生物活性物質發揮作用，如腫瘤細胞源的外泌體通過被自然殺傷細胞吸收，轉移HSP70來激活自然殺傷細胞，促進機體的抗腫瘤功能[9]；三是細胞間受體轉移，如人體血漿中外泌體中含有轉錄因子受體-PPARγ，具有調節免疫相關細胞與脂肪細胞基因表達的作用[10]，四是通過與受體細胞融合后釋放mRNA、microRNA等傳遞遺傳信息，如小鼠肥大細胞源的外泌體可被人的肥大細胞攝入，其攜帶的mRNA進入人細胞胞漿后能被翻譯成蛋白[11]。常見的細胞間信息交流方式是通過細胞釋放蛋白等信號分子來傳遞的，通過作用于靶細胞膜表面受體激活胞內信號通路，從而引起受體細胞功能狀態的變化。外泌體與這些信號傳遞分子不同，是細胞間交流的特殊媒介[12]，其介導的細胞間信息交換確保了細胞信號分子體液彌散過程的順利，保證了部分在細胞外環境中易失活或降解的活性成分能夠順利轉移至靶細胞而發揮其功能。外泌體中運載的活性分子種類豐富，富含脂質、蛋白質、mRNA、microRNA等成分，可調控基因表達影響，影響蛋白的分布和修飾，其膜結構中含有跨膜蛋白PGRL、LAMP1、LAMP2以及有膜轉運融合蛋白annexins、RAN、GTPases，膜上具有能綁定特異性肽鏈的MHC-1/2蛋白，且膜上的脂質筏Chol、ceramide、SM、PC等能限制膜流動，參與物質內吞、跨膜信號轉導、脂質及蛋白定向分選等多種調節。外泌體通過信號通路、細胞自動調節以及關鍵酶反應等方式多途徑、多靶點地對受體細胞功能活動進行調節，有效地提高了細胞間相互作用的精度和效率，更加符合機體生命活動的需要。因此，與外泌體產生相關的重要分子有Ral、ARF6、PLD2、RAB家族等，外泌體在體內廣泛而穩定的分布，對機體包括內分泌調節在內的各項生命活動具有重要意義。

2 外泌體與證候研究的聯系

外泌體具體發揮哪種效應機制是由其生理與病理狀態所決定的，外泌體的成分能夠反映釋放細胞的功能，并且可能包含細胞病態相關的物質信息[13]，如在肝臟中，肝細胞的外泌體具有調節肝細胞增殖的作用[14]，巨噬細胞源的外泌體對肝臟炎癥反應具有調節功能[15]，而肝星狀細胞的外泌體參與了肝纖維化的形成過程[16]，在酒精肝的機理研究中發現，肝細胞能在乙醇激活的Caspase3依賴通路調控下，分泌含有CD40配體的外泌體，進而促進巨噬細胞活化，加重肝臟的炎癥反應[17]；在外界刺激下，神經元通過釋放信號提高少突膠質細胞內Ca2+通道的通透性，促進少突膠質細胞外泌體的釋放[18]，少突膠質細胞的外泌體又能夠增強神經元的活性，這一過程與Akt、Erk1/2激酶的調控密切相關[19]。在疾病的發生過程中，外泌體的結構和功能均發生相應變化，如在心肌梗死的炎癥早期，中性粒細胞來源的外泌體可刺激生成IL-10而發揮抗炎作用，而在炎癥晚期，纖維母細胞分泌的外泌體則會引起MCP-1、MMPs等促炎因子的升高[20]；在神經退行性疾病研究中發現，神經元與腦脊液中的外泌體中檢測到含有豐富的蛋白質侵染因子，提示外泌體在退行性病變的發病中起到一定的作用[21]。外泌體在疾病發生發展中的作用日益被研究者們所重視，不同組織細胞來源的外泌體功能各異，影響著機體各個系統的功能活動與病理改變，并且外泌體的調控作用可能與一些發病機理尚不明確的疾病密切相關。

在證候的現代研究中，病證結合的研究思路具有非凡的指導意義[22]，病證結合是將中醫證的概念與西醫病的理論進行結合，加強了傳統中醫證候理論的科學屬性，結合現代研究技術和方法，使證候更加客觀化，使辨證論治更具科學性。外泌體作為如今各類疾病研究的熱點，同樣可以作為研究中醫證候生物學基礎的基石，以腦卒中為例，有研究表明當腦卒中發生時，成熟的少突膠質細胞在谷氨酸的作用下釋放外泌體，外泌體中包含的Hsc/HSP70、H2O2、SOD-I等能在神經元的應激保護中起到一定的作用，將缺血損傷限制在局部范圍[23]；而腦卒中的證候類型主要以風痰瘀阻證、陰虛風動證、風火上擾證為主[24]，因此，可以將腦卒中不同證候中少突膠質細胞釋放的外泌體作為研究對象，以此探索腦卒中證候規律與發病機制的途徑。在疾病與證候進行之時，機體的相應系統中發生著微觀物質改變，同樣也會引起相關細胞分泌外泌體的結構功能變化，將外泌體引入中醫證候機制的研究中，以病證結合的思維作為橋梁，探索外泌體在證候發生過程中的變化，將有助于更全面地探索證候的生物機制。

3 外泌體與證候診斷的相關性分析

在機體內，不同細胞內包含的物質存在差異，其釋放的外泌體內容物也會有相應的不同，不同生理病理狀態下細胞分泌的外泌體也有不同。外泌體攜帶了特異的生物信息，介導疾病的進程，具有作為生物標志物的潛力[25]。因此，檢測外泌體中特異的分子標志物，比較健康與疾病狀態下外泌體中物質的差異在疾病診斷過程中具有廣闊的應用前景[26]。血液與體液中的外泌體易于分離，穩定性較高，常用于疾病標志物的檢測，如外周血提取的外泌體中的glypican-1+可用于胰腺癌的診斷，其特異性和敏感性優于傳統診斷指標CA19-9[27]；外周血外泌體中miR-141的表達水平可用于前列腺腫瘤的良性與惡性鑒別[28]；肝星狀細胞外泌體表面標志物CD81在慢性C型肝炎中的表達上調，這表明肝星狀細胞外泌體中的CD81可以作為慢性C型肝炎的潛在診斷治療標志物[29]；在急性腎損傷模型中，尿液來源的外泌體中胎球蛋白A含量增加了50倍，其含量變化比傳統標記物肌苷酸發生得更早[30]；尿液來源外泌體中的ATF3和WT-1可能分別是急性腎小管損傷和慢性腎相關足突狀細胞損傷的新型生物標記物，這一結論尚需大樣本的臨床驗證[31]。

無論在生理還是病理狀態下，細胞都能分泌相應的外泌體，其包含的物質能夠代表細胞或系統的一定的生理病理狀況，將外泌體的內容物作為一種生物標志物用于臨床疾病診斷，與中醫辨證論治中微觀辨證的理念息息相關。微觀辨證指明了證候標準化的研究方向，其發展離不開病證結合的科學思維，將研究發現的外泌體內容物中的疾病診斷標志物用于證候的診斷是研究的基本思路，能否在外泌體內容物中發掘出某一證候的診斷標志物也是研究的難點所在。外泌體雖然作為生物標記物的研究位點具有一定優勢，但在研究中仍然需要謹慎對待。首先，外泌體數量龐大，種類繁多，但單個外泌體內容物含量較少，因此在考慮將外泌體作為生物標記物時需考慮內容物的有效豐度。其次，提取出的外泌體的純度直接影響生物標記物的研究結果，外泌體的提取與鑒定尤為重要。最后，由于外泌體來源于各種類型的細胞，如果從血液、汗液、尿液等外泌體種類較多的體液中提取外泌體，則需要進行外泌體來源細胞的篩選。總之，在病證結合思維與微觀辨證方法的指導下，將外泌體作為中醫證候診斷的潛在靶點是很有意義的，但仍需要仔細深入的研究與探索。

4 展望

在機體的各種生理和病理過程中，外泌體從釋放到與特定受體細胞結合傳遞信息，發揮了重要的調節作用，在病證結合的研究思路下，外泌體可作為證候機制研究的一條新途徑；同時，深入探討各類細胞釋放的外泌體的結構和功能，能夠為微觀辨證和證候的診斷與標準化提供新的思路。此外，由于外泌體形態較小，易透過血腦屏障[32]，結合方證研究的相關思路，中藥復方對外泌體的作用也可能成為證候研究的一個有效手段。總之，外泌體作為一個新的研究熱點，如何使其與證候研究相契合，發揮出最大的潛力，需要中醫藥研究者們共同的探索與思考。

[1]Tetta C，Ghigo E，Silengo L，et al.Extracellular vesicles as an emerging mechanismofcell-to-cell communication[J].Endocrine，2013，44(1):11.

[2]Johnstone R M，Adam M，Hammond J R，et al.Vesicle formation during reticulocyte maturation.Association of plasma membrane activities with released vesicles (exosomes)[J].Journal of Biological Chemistry，1987，262(19):9412.

[3]Raposo G，Nijman HW，Stoorvogel W，et al.B lymphocytes secrete antigenpresenting vesicles[J].Journal of Experimental Medicine，1996，183(3):1161.

[4]SimpsonR，JensenSJ.Proteomicprofilingofexosomes:currentperspectives[J].Proteomics，2008，8(19):4083.

[5]吳金恩，丁軍濤.外泌體生物學功能及應用研究進展[J].動物醫學進展，2016，37(12):90-94.

[6]LeeY，ElAndaloussiS，WoodMJA.Exosomesand microvesicles:extracellularvesicles for genetic information transfer and gene therapy[J].Human MolecularGenetics，2012，21(R1):R125.

[7]Camussi G，Deregibus M C，Bruno S，et al.Exosomes/microvesicles as a mechanism of cell-to-cell communication[J].Kidney International，2010，78(9):838-848.

[8]Zakharova L，Svetlova M，Fomina A F.T cell exosomes induce cholesterol accumulation in human monocytes via phosphatidylserine receptor.J Cell Physiol[J].Journal ofCellular Physiology，2007，212(1):174.

[9]Lancaster G I，Febbraio M A.Exosome-dependent Trafficking of HSP70 A NOVELSECRETORYPATHWAYFOR CELLULAR STRESSPROTEINS[J].JournalofBiologicalChemistry，2005，280(24):23349.

[10]Looze C，Yui D，Leung L，et al.Proteomic profiling of human plasma exosomes identifies PPARgamma as an exosome-associated protein[J].Biochemical&Biophysical Research Communications，2009，378(3):433.

[11]ValadiH，Ekstr?mK，BossiosA，etal.Exosome-mediated transfer ofmRNAs andmicroRNAsisanovelmechanismofgeneticexchangebetweencells[J].Nature Cell Biology，2007，9(6):654-659.

[12]Sun D，Zhuang X，Zhang S，et al.Exosomes are endogenous nanoparticles that can deliver biological information between cells[J].Advanced DrugDeliveryReviews，2013，65(3):342-347.

[13]Mathivanan S，Lim J W E，Tauro B J，et al.Proteomics analysis of A33 immunoaffinity-purified exosomes released from the human colon tumor cell line LIM1215 reveals a tissue-specific protein signature[J].Molecular&Cellular Proteomics Mcp，2010，9(2):197.

[14]Nojima H，Freeman CM，Schuster R M，et al.Hepatocyte exosomes mediate liver repair and regeneration via sphingosine-1-phosphate[J].Journal ofHepatology，2016，64(1):60.

[15]Saha B，Momenheravi F，Kodys K，et al.MicroRNA Cargo of Extracellular Vesicles fromAlcohol-exposed Monocytes Signals Naive Monocytes to DifferentiateintoM2Macrophages[J].JournalofBiologicalChemistry，2016，291(1):149.

[16]Chen L，Chen R，Kemper S，et al.Suppression of fibrogenic signaling in hepatic stellate cells byTwist1-dependent microRNA-214 expression:Role of exosomesinhorizontaltransferofTwist1[J].AmericanJournalofPhysiologyGastrointestinal&LiverPhysiology，2015，309(6):G491.

[17]Verma VK，Li H，WangR，et al.Alcohol stimulates macrophage activation through caspase dependent hepatocyte derived release of CD40L containing extracellular vesicles[J].Journal ofHepatology，2016，64(3):651.

[18]Carsten F，Dominik F，Eva-Maria K A.Emerging Roles of Exosomes in Neuron Glia Communication[J].Frontiers in Physiology，2012，3(3):119.

[19]Jin K，MaoXO，Zhu Y，et al.MEKand ERKprotect hypoxic cortical neuronsviaphosphorylationofBad[J].JournalofNeurochemistry，2002，80(1):119.

[20]Distler J H W，PisetskyDS，Huber LC，et al.Microparticles as regulators of inflammation:Novel players of cellular crosstalk in the rheumatic diseases[J].Arthritis&Rheumatism，2005，52(11):3337-3348.

[21]Berrone E，Corona C，Mazza M，et al.Detection of cellular prion protein in exosomes，derived from ovine plasma[J].Journal of General Virology，2015，96(12):3698.

[22]李柳驥，陳家旭.試述中醫病證結合的關系[J].北京中醫藥大學學報，2004，27(3):7-9.

[23]Frühbeis C，Fr?hlich D，Wen P K，et al.Neurotransmitter-Triggered Transfer of Exosomes Mediates Oligodendrocyte Neuron Communication[J].PLoSBiology，2013，11(7):e1001604.

[24]陳光艷.缺血性腦卒中患者中醫體質、中醫證候類型、5-HT、NE與腦卒中后抑郁發病的關系研究[D].濟南：山東中醫藥大學，2014.

[25]覃思華，鄭磊.外泌體蛋白質組學研究進展[J].臨床檢驗雜志，2016，34(12):927-930.

[26]朱偉，李雅紅.Exosomes(外體)在臨床診斷和治療中的應用[J].臨床檢驗雜志，2012，30(10):846-849.

[27]Melo S A，Luecke L B，Kahlert C，et al.Glypican-1 identifies cancer exosomes and detects early pancreatic cancer[J].Nature，2015，523(7559):177.

[28]ThéryC，Duban L，Segura E，et al.Indirect activation ofna?ve CD4+Tcells bydendritic cell-derived exosomes[J].Nature Immunology，2002，3(12):1156-1162.

[29]Welker MW，Reichert D，Süsser S，et al.876 Soluble SerumCD81 is Elevated in Patients with Chronic Hepatitis C and Correlates with Alanine Aminotransferase SerumActivity[J].Plos One，2012，7(2):S341-S341.

[30]Zhou H，Pisitkun T，Aponte A，et al.Exosomal Fetuin-A identified byproteomics:a novel urinary biomarker for detecting acute kidney injury.[J].Kidney International，2006，70(10):1847-1857.

[31]Zhou H，CheruvankyA，Hu X，et al.Urinaryexosomal transcription factors，a newclass ofbiomarkers for renal disease[J].KidneyInternational，2008，74(5):613-621.

[32]SquadritoML，BaerC，BurdetF，etal.EndogenousRNAsmodulatemicroRNAsortingtoexosomesandtransfertoacceptorcells[J].CellReports，2014，8(5):1432.