克柔念珠菌的耐藥機制及抗真菌對策研究進展

劉然

（首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院檢驗科，北京 100026）

0 引言

在臨床實踐過程中，常出現(xiàn)的會引發(fā)感染的念珠菌種類達17種之多，白念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、熱帶念珠菌以及近平滑念珠菌就是最為常見的幾類致病菌，超過90%的感染由這幾類念珠菌導(dǎo)致。抗真菌藥物的使用是臨床常見的治療方式，但此類藥物的長期大量應(yīng)用會引發(fā)念珠菌耐藥性的產(chǎn)生。其中對氟康唑天然耐藥的克柔念珠菌對抗真菌藥物的耐藥率最高，已經(jīng)成為臨床上最為難治的念珠菌，對患者生命構(gòu)成嚴重的威脅。對克柔念珠菌的耐藥性的產(chǎn)生機制以及相應(yīng)治療藥物的進一步研究已成為醫(yī)學(xué)界各方關(guān)注的重點。針對此，從克柔念珠菌的感染和耐藥現(xiàn)狀、耐藥性產(chǎn)生機理和相關(guān)臨床診治策略等不同方面進行了詳盡闡述。

1 克柔念珠菌的感染及耐藥現(xiàn)狀

在國內(nèi)，因標本來源、時間、地區(qū)及氣候的不同，各個醫(yī)院的克柔念珠菌的分離率從1.4%-8.86%不等[1-9]，對氟康唑、伊曲康唑的耐藥率從27.78%-100%不等[1-9]，對唑類藥物耐藥現(xiàn)象嚴重。臺灣地區(qū)克柔念珠菌對氟康唑的耐藥率相比較2010年從2.2%上升到2.8%，對伏立康唑的耐藥率從0.3%上升至0.5%[10]，在另一項美國研究顯示，克柔念珠菌對棘白菌素類藥物耐藥率在2008年僅為4.2%，至2014年，其耐藥率已升為7.8%[11]。

2 克柔念珠菌的耐藥機制

2.1 對唑類藥物的耐藥機制

羊毛甾醇14α-去甲基化酶（14α-demythylase，14-DM）是唑類藥物耐藥機制中的作用靶酶，該酶是由ERG11基因編碼產(chǎn)生的，編碼蛋白ERG11p，在麥角甾醇生物的合成過程中處于關(guān)鍵位置，是真菌細胞膜的主要甾醇成分，經(jīng)由和14-DM結(jié)合，唑類藥物抑制了其生物活性，導(dǎo)致甾醇中間產(chǎn)物的堆積，阻礙麥角固醇的合成，最終使念珠球菌的胞膜結(jié)構(gòu)及功能發(fā)生改變，最終產(chǎn)生抗藥性。克柔念珠菌對唑類藥物的耐藥機制可能由以下幾種引起。

2.1.1 藥物靶酶ERG11編碼基因的突變和過度表達

克柔念珠菌的ERG11基因大小為1587bp，耐藥株克柔念珠菌中ERG11的mRNA表達增多，和耐藥性呈正相關(guān)。ERG11基因的突變可導(dǎo)致酶結(jié)構(gòu)變化，最終造成其功能差異，降低和唑類藥物間的親合力，出現(xiàn)耐藥性。相關(guān)研究結(jié)果提示，ERG11基因上G487T（A114S）和T916C（Y257H）的錯義突變和唑類耐藥相關(guān)[12]。有研究[13]提到，Upc2p在調(diào)節(jié)麥角固醇的代謝中起到了重要作用，可以對外排泵的基因表達產(chǎn)生影響。Upc2p中G648D和A643T的功能性突變，均可造成某一丙氨酸結(jié)構(gòu)改變，變?yōu)樘K氨酸，刺激ERG11的過度表達，提高菌株耐藥性[14]。在唑類耐藥的臨床分離株中，已報道ERG11p中至少有60個氨基酸被取代[12]。

2.1.2 靶位拷貝數(shù)的增多

有關(guān)研究提示，當(dāng)唑類耐藥株中的ERG11基因出現(xiàn)拷貝數(shù)增加的情況，就會導(dǎo)致有絲分裂重組、基因突變和等臂染色體形成等情況出現(xiàn)，最終提高對唑類藥物耐藥性發(fā)生的幾率[15]。

2.1.3 通過藥物外排轉(zhuǎn)運蛋白和減少攝取，而降低細胞內(nèi)藥物濃度

真菌中可導(dǎo)致唑類耐藥的外排泵主要包括兩類，分別是ATP結(jié)合盒（ABC）轉(zhuǎn)運蛋白（如CaCdr1和CaCdr2）和主要協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白超家族（MFS）轉(zhuǎn)運蛋白（如CaMdr1），前者轉(zhuǎn)運藥物使用的能量來源于ATP的水解，后者利用細胞質(zhì)膜電化學(xué)梯度轉(zhuǎn)運底物。在克柔念珠菌中，菌株應(yīng)對唑類藥物暴露時，ABC1會被強力上調(diào)，因此它在天然耐藥方面，可能發(fā)揮了重要作用[16]。臨床上已經(jīng)從暴露于唑類抗真菌藥物患者連續(xù)分離的菌株中證實，多因素耐藥的逐步發(fā)展與藥物暴露、CDR和（或）MDR基因表達[17]以及其他機制（如ERG11過表達）有關(guān)。

2.1.4 其他的麥角固醇的生物合成途徑成分的修飾

ERG3基因編碼固醇Δ5,6-去飽和酶，有助于固醇的生物合成。相關(guān)研究結(jié)果顯示[18]，把克柔念珠菌至于內(nèi)含伊曲康唑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，會出現(xiàn)麥角固醇含量減少，14-甲基3,6-二醇含量增多，細胞生長停滯的情況。而提高培養(yǎng)基中氯康唑濃度，則會發(fā)生14-去甲基糞甾醇蓄積的情況，據(jù)此，我們推測甾醇ERG3在克柔念珠菌耐氟康唑機制中起到了重要影響。

2.1.5 生物膜和持留細胞

生物膜是微生物自然生長最普遍的形式之一，其特性是抵抗常用抗真菌藥物。在生物膜里，藥物外排轉(zhuǎn)運蛋白基因CDR和MDR在生物膜形成過程中被上調(diào)[19]。持留細胞生長速度不如正常生物被膜細胞，通過“休眠-生長-增殖”應(yīng)對逆境的脅迫[20]，能夠在高濃度抗菌藥物下存活并且形成菌落[21]。

2.2 對多烯類藥物的耐藥機制

2.2.1 細胞壁組分發(fā)生變化

以細胞壁與膜作用為基礎(chǔ)，兩性霉素B對克柔念珠菌的指數(shù)生長期進行了抑制，而細胞壁內(nèi)葡聚糖的水平改變最終導(dǎo)致了耐藥性的產(chǎn)生。當(dāng)真菌細胞壁幾丁質(zhì)含量降低時耐藥性產(chǎn)生[22]。

2.2.2 交叉耐藥

經(jīng)由和真菌細胞膜表面的麥角固醇相互結(jié)合，多烯類藥物讓細胞膜表面出現(xiàn)許多微孔，細胞膜完整性受損，膜內(nèi)重要組成物質(zhì)外泄，真菌死亡。然而，若真菌抗唑類藥物耐藥性出現(xiàn)，真菌細胞就會失去合成麥角固醇的能力，最終讓兩性霉素B的抗菌活性消失。所以唑類藥物與多烯類藥物間存在交叉耐藥[23]。

2.3 對丙烯胺類藥物的耐藥機制

利用對角鯊烯環(huán)氧化酶的抑制作用，丙烯胺類藥物擾亂了真菌甾醇的合成進程，造成角鯊烯的細胞內(nèi)堆積，引起真菌的脂質(zhì)代謝紊亂，最終起到抗真菌的效果[24]。現(xiàn)階段見報的與丙烯胺類藥物耐藥性有關(guān)的研究不多,但在臨床應(yīng)用過程中，耐特比萘芬的毛孢子菌屬(T richophyton rubrum)已經(jīng)出現(xiàn)對此類耐藥株中所蘊含的角鯊烯環(huán)氧化酶進行編碼基因的序列解析,研究結(jié)果提示所有菌株都含有1個氨基酸突變L 393F。

2.4 對氟胞嘧啶類藥物的耐藥機制

耐氟胞嘧啶類藥物的耐藥性產(chǎn)生的機理常是因特定的氨基酸被替換最終造成前體藥物的吸收及修飾過程產(chǎn)生變化，最終出現(xiàn)耐藥性[25]。還有研究顯示，其耐藥性可能和胞嘧啶透酶、胞嘧啶脫氨酶缺陷或胸苷酸合酶活性變化有關(guān)。

2.5 對棘白菌素類藥物的耐藥機制

有研究[26]提出棘白菌素的耐藥機制一般與以下幾類因素有緊密聯(lián)系：①FKS1基因突變。②細胞膜表明轉(zhuǎn)運蛋白Sbe2P過度表達。③藥物過度外排。在這之中，F(xiàn)KS1基因突變的影響已獲得了普遍認可。Kahn等[27]的研究結(jié)果提示因FKS1中T2080K發(fā)生雜合突變，讓Phe655→Cys失去了靶酶Fks1p亞單元內(nèi)的(1，3)β-D葡聚糖合成，最終造成了克柔念珠菌抗棘白菌素的耐藥性產(chǎn)生。

3 抗克柔念珠菌對策的研究進展

3.1 建立標準化抗真菌藥物敏感實驗[28]

近20年來，伴隨藥敏試驗方式的持續(xù)完善，抗真菌藥物的敏感性結(jié)果的真實性更為可信。但也因患者免疫狀態(tài)的不同，基礎(chǔ)疾病的差異，藥物間相互影響，抗真菌藥物劑量高低區(qū)別，療程長短和血藥濃度水平高低的不同，和別種感染因素的影響，如膿腫引流狀況，插入導(dǎo)管是否去除等因素造成藥敏試驗結(jié)果與臨床治療情況不符。這就需要我們判斷真菌藥敏結(jié)果要慎重，在將其他會對治療效果產(chǎn)生不利影響的因素排除后，將最初致感染菌提取出來，同時和治療失敗后分離出的真菌的MIC進行比較，若其MIC顯著提升，則顯示其耐藥性提高。

3.2 新藥研發(fā)

3.2.1 嗜鉻粒蛋白A(CGA)-N46

CGA是分布于內(nèi)分泌細胞嗜鉻顆粒和神經(jīng)細胞中的一種可溶性蛋白[29]。經(jīng)過對CGA中不同衍生片段的抗菌活性進行檢測，結(jié)果提示CGA N端的CGA-46顯示出極強的抗真菌活性[30]。CGA-N46能對進行測試的念珠菌屬的生長進行抑制，在這之中，克柔念珠菌的敏感性最強。利用暫時對磷脂膜的穩(wěn)定性進行去除，造成線粒體功能障礙，同時抑制DNA合成，CGA-N46被認為是抗克柔念珠菌感染的最新化合物[31]。

3.2.2 銀納米顆粒（AgNP）

AgNPs指利用環(huán)保方式，將半胱氨酸視作還原劑合成產(chǎn)生的。在某些學(xué)者的認知中，AgNP可被視為開發(fā)新型抗真菌劑的最新化合物，它在成纖維細胞中具有最低的細胞毒性，同時針對具有抗常規(guī)真菌化合物抗性的念珠菌屬有較強致死性。這就是此類藥物的新藥研究的潛力體現(xiàn)[32]。

3.2.3 羧甲基殼聚糖（CM-殼聚糖）

Tan[33]等通過深刻研究，顯示CM-殼聚糖不論是針對單個和混合物中生物膜的非白色念珠菌，均具有顯著抑制作用，常見菌屬包括了熱帶假絲酵母，近平滑假絲酵母，還包括了克柔假絲酵母以及光滑念珠菌。所以CM-殼聚糖不單單可以起到減低念珠菌細胞代謝活性的作用，還可以刺激生物膜的建立和發(fā)展，在進行新藥物研究中極具價值。

3.2.4 艾沙康唑

艾沙康唑有可預(yù)測的和與劑量成正比的藥動學(xué)，現(xiàn)已完成Ⅲ期臨床試驗，一般被用來治療侵襲性念珠菌病、念珠菌血癥，還可被用于治療侵襲性曲霉病和較為少見的曲霉感染[34]。在艾莎康唑的分子結(jié)構(gòu)式中，其側(cè)鏈具有很高的真菌CYP51蛋白親和力，造成其抗真菌譜范圍更廣，甚至將對別種唑類抗真菌藥所耐受的真菌也囊括其中[34]。

3.2.5 阿巴康唑

阿巴康唑是一種生物利用度高、抗真菌活性強的口服制劑，針對足廯已完成Ⅰ期試驗評價，用于腳趾甲真菌病治療已完成Ⅱ期臨床試驗[35]。

3.2.6 福司氟康唑

福司氟康唑是氟康唑的磷酸酯前體藥物，是以氟康唑為起始原料通過兩部合成。福司氟康唑靜脈給藥2-3d即可達到有效血藥濃度。安全性好，不良反應(yīng)小[36]。

3.3 聯(lián)合用藥

相關(guān)動物結(jié)果提示，小檗堿及黃芩素能有效提升唑類藥物的抗真菌效應(yīng)[37]。王維欣等[38]研究表明，沒食子酸與氟康唑聯(lián)用對耐藥克柔念珠菌的浮游菌表現(xiàn)出體外協(xié)同抗真菌作用。有些研究結(jié)果顯示[39]，枸櫞酸托瑞米芬具有明顯提升卡泊芬凈及兩性霉素B體內(nèi)外抗生物被膜活性的作用。

3.4 老藥新劑型

兩性霉素B脂質(zhì)體是兩性霉素B的一種新劑型，發(fā)揮其最強殺菌效能的同時降低其毒副作用[26]。20世紀90年代，研發(fā)了3種不同的兩性霉素B的脂類復(fù)合體，分別是兩性霉素B脂質(zhì)體、兩性霉素B脂質(zhì)復(fù)合體和兩性霉素B膠狀分散體。制霉菌素脂質(zhì)體是游離制霉菌素包裹在多層脂質(zhì)中，保留其抗菌活性的同時降低其腎毒性。灰黃霉素的卵磷脂脂質(zhì)體也于20世紀90年代研發(fā)，其肝毒性大大低于常規(guī)灰黃霉素口服劑。

3.5 抗真菌中草藥

中草藥因其所具備的來源多、抗菌譜廣、毒性小、耐藥性產(chǎn)生率低等優(yōu)勢引起了多方關(guān)注。有研究提示，大蒜、地錦草、黃芩、魚腥草等都具備較高的抗真菌性[40]。還有研究對這一輪點進行了進一步肯定[41]，研究顯示大蒜素可有效抑制生物膜的黏附和胞外多糖的產(chǎn)生；苦參堿則能夠顯著阻礙白念珠菌的黏附和菌絲生長；黃芪苷可抑制真菌DNA的合成而達到抗菌作用。

4 小結(jié)

克柔念珠菌的耐藥現(xiàn)象嚴重是多種耐藥機制共同作用的結(jié)果，不同耐藥機制的結(jié)合也形成了其對氟康唑的天然耐藥。在上文中所提及的耐藥機制仍待我們的深層次研究，也許會有未發(fā)現(xiàn)的耐用機制亟待進一步闡明，從而為研制新的抗真菌藥物提供新思路，也可以為臨床合理使用抗真菌藥物提供理論依據(jù)。