甜瓜鏈格孢葉斑病的2種抗性接種鑒定方法比較

姚協豐，李蘋芳，朱凌麗，徐錦華，張 曼，任潤生，劉 廣，侯 茜，羊杏平

(江蘇省農業科學院蔬菜研究所 江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點實驗室，江蘇 南京 210014)

甜瓜(CucumismeloL.)是一種重要的葫蘆科作物，世界前八大水果之一。我國甜瓜種植面積和產量分別占世界總量的45%和55%以上，因其經濟效益顯著，在設施農業生產中占有重要地位[1]。葫蘆科鏈格孢葉斑病(Alternariaalternata(Fr.) Keissler)，又稱葉枯病，危害植物葉片、莖蔓和果實等部位，田間以葉片發病為主[2]。研究表明，鏈格孢葉斑病發病范圍廣，涉及葫蘆科多種作物，如黃瓜、西瓜、南瓜、甜瓜、西葫蘆、苦瓜、絲瓜、瓠瓜、冬瓜等主要瓜類作物。以甜瓜為例，近年來在新疆、上海、北京、甘肅等地甜瓜作物均發生嚴重的鏈格孢葉斑病，由于發病后的植株葉片干枯死亡，對甜瓜生產造成嚴重的影響[2-5]。前期我們對江蘇南京地區甜瓜葉斑病進行初步調查發現，南京地區甜瓜生產區域有典型的甜瓜鏈格孢葉斑病癥狀病株，田間發病率達到30%，危害嚴重。

生產上化學防治是葉部病害最主要的防治方法，但長期使用化學農藥極易使病原菌產生抗性，且對環境與人類身體健康均危害很大[6]。因此選育抗病品種是防治鏈格孢葉斑病最根本、最有效的方法。但是目前國內尚未有系統開展甜瓜抗鏈格孢葉斑病抗性的研究。為此，建立可靠的鏈格孢葉斑病鑒定方法，進行甜瓜種質資源對鏈格孢葉斑病抗性的評價，對于選育鏈格孢葉斑病抗性品種，從而克服或減輕鏈格孢葉斑病的危害，具有重要的實踐指導價值。本研究比較了活體接種與離體接種2種不同鏈格孢葉斑病菌的接種方法，通過對20份甜瓜種質資源進行接種鑒定，建立了穩定可靠的鏈格孢葉斑病菌離體鑒定體系，2種方法同時篩選出5份具有中等抗性的甜瓜抗性資源。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗于2016年3—4月期間在江蘇省農業科學院蔬菜研究所玻璃溫室進行，3月23日播種，4月20日接種，每個材料接種16株，同時取樣第3片真葉作為待檢測用的離體葉片，共取9片，4月26日、4月28日、4月29日統計病情。接種所用鏈格孢葉斑病菌[Alternariaalternata(Fr.) Keissler]菌株由江蘇省農業科學院蔬菜研究瓜類實驗室前期在田間病株收集、分離和致病性鑒定，因鏈格孢葉斑病菌株AlternariaalternateLH1601致病力強且穩定性好，作為抗病性接種鑒定菌株。育苗基質采用品氏進口育苗基質，滅菌處理后備用。

供試20份甜瓜材料由江蘇省農業科學院蔬菜研究所瓜類研究室自己選育并保存，材料名稱和來源見表1。

表1 供試甜瓜材料及來源

1.2 鏈格孢葉斑病菌培養及產孢

鏈格孢葉斑病菌分生孢子產孢方法。挑取LH1601的純性培養物接種于PDA固體培養基(20%土豆，2%葡萄糖，1.5%瓊脂)，置于26～28 ℃培養箱內進行培養。選取新鮮完整的甜瓜葉片，經滅菌蒸餾水沖洗干凈后，再用75%酒精擦拭表面并晾干備用。用直徑0.7 cm的滅菌打孔器切取上述新鮮培養1周的菌塊，倒置于葉片正面，于28 ℃下培養。5～7 d后用刀片取下菌塊所在葉片，于研缽中研磨，并經4層紗布過濾。濾液即為分生孢子液，顯微鏡下用血小球計數板計數并稀釋成5×105孢子·mL-1的孢子懸浮液用于噴霧接種。

1.3 室外苗期活體接種

參照Zhang等[7]的接種方法，在甜瓜長至3～4片真葉時，在植株正反面噴施預先配制好的5×105孢子·mL-1孢子懸浮液(含1% Tween 80)，直至葉片滴水為止。前3 d搭塑料拱棚保濕，保持相對濕度90%以上，3 d后揭開小拱棚，7、10 d調查統計病情。

葉片病級分級。0級為無可見病斑，1級為有疑似病斑，2級為病斑面積<10%，3級為10%≤葉斑面積<25%，4級為25%<葉片壞死面積≤50%，5級為葉片壞死面積>50%。

根據平均病情級別數(RI)確定鏈格孢葉斑病抗性級別。高抗(HR)，RI<1.0；抗(R)，1.0≤RI<2.0；中抗(MR)，2.0≤RI<3.0；感病(S)，3.0≤RI<4.0；高感(HS)，RI≥4.0。

平均病情級別數計算公式：

RI=Σ(級值×株數)/總株數[6-7]。

1.4 離體葉片菌絲塊接種

離體葉片菌絲塊接種方法參照Wang等[8]方法稍做修改，取4 ℃冰箱保存的LH1601的純性培養物接種于PDA固體培養基，于26～28 ℃培養1周。取健康甜瓜植株第3～4片真葉，經滅菌蒸餾水沖洗干凈，晾干后置于墊有無菌濾紙的培養皿中，葉片正面朝上。用0.5 cm的打孔器切取菌絲塊，正面朝下置于甜瓜葉片上，每張葉片左右兩邊各接1個菌絲塊。培養皿放在溫度(26±1)℃，16 h光照/8 h黑暗，相對濕度約90%的光照培養箱中培養。每處理3張葉片，重復3次，5 d后測量菌絲塊周圍的菌絲侵染擴展半徑。

1.5 統計分析

采用SAS8.0統計軟件對試驗數據進行方差分析。離體葉片菌絲塊接種的菌絲侵染擴展半徑與活體接種鑒定后RI的相關性采用皮爾遜(Pearson)相關性分析方法(P≤0.05水平)。

2 結果與分析

2.1 不同甜瓜材料苗期活體接種鑒定抗病性

采用噴霧接種方法對20份甜瓜材料進行鏈格孢葉斑病菌的室外活體接菌實驗，供試20個甜瓜材料接種4～7 d后均開始發病，葉部出現鏈格孢葉斑病典型癥狀，即葉片出現黃色小斑點，病斑性狀不規則，后期病斑逐漸擴大，呈退綠褐色病斑(圖1)。不同材料間發病程度輕重有所不同，但未發現免疫材料，未接種對照均未發病。

圖1 苗期活體葉片接種甜瓜鏈格孢葉斑病發病情況

由表2和3可知，5份甜瓜材料發病相對較輕，表現為中抗，其RI在2～3，占總數的25%；表現感病的材料有5份，RI在3.6～3.9，占總數的25%；其余材料均表現為高感，平均病情級別數均≥4，表現對鏈格孢葉斑病較為敏感。

2.2 離體葉片菌絲塊接種鑒定不同甜瓜材料鏈格孢葉斑病抗性

表2 不同甜瓜材料苗期對鏈格孢葉斑病抗性鑒定結果

注：同列數據后無相同小寫字母表示差異顯著(P≤0.05)。

表3 甜瓜材料對鏈格孢葉斑病的抗性評價

將大小一致的菌絲塊接種于新鮮甜瓜葉片，觀察菌絲塊擴展反應，5 d后測量菌絲塊周圍的菌絲侵染擴展半徑。如圖2所示，所選20份材料接種鏈格孢菌絲塊后周圍均有菌絲侵染生長。測量發現半徑從1.50～4.75 cm不等，各材料間菌絲侵染擴展范圍大小差異顯著。如表2所示，其中5份材料侵染擴展半徑≤2 cm，表現為中抗；5份甜瓜材料擴展半徑均>2 cm，表現為感病；其他10份甜瓜材料擴展半徑≥4 cm，表現為高感。

圖2 苗期離體葉片接種甜瓜鏈格孢葉斑病發病情況

2.3 離體葉片菌絲塊接種與苗期活體接種鑒定比較相關性分析

為揭示離體葉片菌絲塊接種方法是否可替代活體接種法，采用SAS8.0統計軟件對試驗數據進行皮爾遜相關性分析。表2結果顯示，菌絲侵染擴展半徑與活體接種鑒定后RI呈顯著相關，擴展半徑與RI的相關系數達0.91。由此可見，離體葉片菌絲塊接種方法是穩定可靠的。

3 討論

離體葉片接種法，一方面可以大大縮短抗性鑒定周期、提高抗性鑒定的效率，另一方面操作簡單、環境因素可控，重復率高；此外，此方法具有不影響篩選材料進一步生長的優點，抗性材料可以繼續用于其他用途[9]。所以目前離體葉片接種法已經被廣泛應用于植物真菌病害如蔓枯病的品種抗性鑒定中[10-11]，但鏈格孢葉斑病菌離體葉片鑒定還未有報道。本研究通過采用室內離體葉片和室外苗期接種2種不同的接種方法對20份甜瓜材料進行了鏈格孢葉斑病抗性鑒定，研究結果顯示，離體葉片鑒定結果與室外苗期活體接種結果一致，即菌絲侵染擴展半徑可用于判斷供試甜瓜材料對鏈格孢葉斑病敏感性。2種方法篩選出相同的5份甜瓜材料具有中等抗性，相關性達到0.91(P≤0.05)。因此，本研究建立了一種簡單、有效且容易重復的甜瓜葉部病害鏈格孢葉斑病鑒定方法。

本研究所采用的20份甜瓜材料均不同程度感染鏈格孢葉斑病，未發現對鏈格孢葉斑病菌免疫的資源。其中5份材料對鏈格孢葉斑病菌有一定抗病性，根據RI判斷達到中抗水平。這5份材料中2份為高代自交系，分別為MM-2(菜瓜高代自交系)，MM-3(新疆甜瓜高代自交系)，另3份材料為新組合。這2個高代自交系可望作為下一步育種親本材料。由于所選材料有限，為發現更多優異抗性資源，需加大種質資源數量，挖掘蘊藏潛在有價值的抗性基因資源，用于抗鏈格孢葉斑病菌甜瓜品種的選育和遺傳改良。

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