嵌合抗原受體T細胞治療原發性肝癌的研究進展

許　洋，張雅敏，王　建，劉子榮

(1.天津醫科大學第一中心臨床學院，天津 300070；2.天津市第一中心醫院 肝膽外科，天津 300192)

原發性肝癌(簡稱肝癌)為比較常見的惡性腫瘤，其在癌死因中位列第2位，僅2015年全世界新發患者數約74.5萬例[1]。肝癌的主要治療手段包括手術治療(肝切除或肝移植)、肝動脈化療栓塞(transarterial chemoembolization,TACE)以及局部消融療法等。盡管分子靶向等生物治療有所進展[2]，能延長部分患者的生存期，但整體療效有待提高。近年來，免疫治療實體腫瘤獲得了長足的進步，以嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor，CAR)T 細胞為代表的靶向免疫治療的成就尤其突出[3]。其成為多種腫瘤治療的不可或缺的手段之一，被《Science》雜志列為 2013 年10大科學突破的首位[4]，由于其在體外及臨床前實驗甚至臨床試驗中表現出較好的靶向性及持久性，所以擁有著巨大的發展潛力及前景。本文將著重介紹CAR-T細胞及其對于原發性肝癌相關靶點的作用效果，以及不良反應及相關措施。

1　CAR-T細胞的原理、組成及發展

將識別腫瘤相關抗原(TAA)的單鏈抗體(scFv)與T 細胞活化基序在體外基因重組形成重組質粒，經過反轉錄病毒或慢病毒載體、轉座子或轉座酶系統或直接 mRNA 傳導到T細胞內，并于細胞表面形成融合蛋白，使患者T細胞表達腫瘤抗原受體，轉染后經純化和大批擴增后的T細胞，稱為嵌合抗原受體T細胞(CAR-T細胞)。腫瘤抗原單克隆抗體的可變區與T細胞受體(TCR)的亞基嵌合在一起，此種T細胞既具備抗體的特異性，以非主要組織相容復合體(major histocompatibility complex,MHC)限制性的方法識別特定抗原，并且能有效的使T細胞活化，加強其識別和殺傷腫瘤的能力[5]。

CAR-T細胞由胞外抗原結合區、鉸鏈區、跨膜區和胞內信號區構成。胞外抗原結合區主要是單克隆抗體的單鏈可變區序列，或激素的信號肽、細胞因子和膜受體的胞外區等，與傳統TCR不同，其可直接識別抗原，不需要對抗原肽-MHC復合物形式進行識別，并且蛋白質類及糖脂類均能被識別[6]。CAR發揮作用依賴鉸鏈區的大小、靈活性和活動范圍，靈活的鉸鏈區對于CAR-T細胞識別抗原是必要的。跨膜區在T細胞活化及CAR二聚化起著關鍵作用，含有CD3跨膜區的 CAR對于T細胞激活作用較其他膜分子的跨膜區要明顯很多[7]。胞內信號區為T細胞受體TCR/ CD3ζ鏈或免疫球蛋白 Fc受體 FcεRIγ鏈，含有免疫受體酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motifs，ITAMs)，可發揮信號傳導功能。

目前CAR的發展歷經了4代：第1代CAR主要由scFv及單一信號分子(如CD3的ζ鏈)組成，其只能識別靶抗原并激活T細胞，由于不存在共刺激分子，T細胞只可進行短暫分裂及較低水平的細胞因子的分泌，其殺瘤作用持續性及殺傷性較弱。第2代CAR增加了共刺激信號域，將共刺激分子(如 CD28、4-1BB等)的胞內域重組到基本骨架中，實現了共刺激分子和細胞內信號的雙重活化，使 T 細胞持續增殖裂解并高水平的細胞因子分泌，提高 T 細胞的殺瘤能力。第3代CAR則增加2個以上的共刺激分子，使T細胞的細胞毒性、增殖活性、存活時間和細胞因子釋放等均有顯著提高，但靶向識別能力降低，可產生細胞因子風暴[8]。第 4 代 CAR(又稱 TRUCKs)，在第3代CAR的基礎上增加了編碼 CAR和/ 或其反應性啟動子的載體，在轉基因產生的細胞因子作用下 CAR 產生有效信號并招募免疫系統其他成員，增強抗腫瘤免疫效應。

CAR-T技術的關鍵點在于腫瘤相關靶點的選擇。靶點選擇優先考慮正常組織中不表達或表達很少的腫瘤特異性抗原(TSA)，但由于當前腫瘤特異性抗原的發現較少，故目前應用于CAR-T的靶點為正常細胞表達較少，而在腫瘤細胞增殖時高度表達的腫瘤相關抗原(TAA)。當前的治療通過將抗原特異性人單克隆抗體或設計人源化或嵌合單克隆抗體分離，以此來靶向攻擊腫瘤相關抗原，如利妥昔單抗(CD20)對于淋巴瘤，曲妥單抗(HER2/NEU)對于乳腺癌等，所以對于原發性肝癌相關的靶點的選擇至關重要。

2　原發性肝癌相關靶點

利用免疫方法治療原發性肝癌經過多年測試，運用細胞因子或單克隆抗體的方法，大多數已證實其能成功使腫瘤發生特異性免疫反應并且安全有效，但并不能反映確切的臨床效果[9]。在基于T細胞的免疫療法的成功開發之前，需進行免疫反應的TAA的鑒定與篩選。

2.1　磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)

GPC3 作為一種跨膜糖蛋白，其在細胞的增殖、分化乃至轉移中起到重要作用。GPC3在 HCC中呈特異性高表達，且在初期即可檢出，尤其在小肝癌及 AFP 陰性的HCC患者中陽性率很高[10]。在肝癌組織中GPC3水平明顯升高，以GPC3為腫瘤相關抗原，構建出具有殺傷作用的CAR-GPC3-T細胞，并在小鼠肝癌模型觀察其功效，發現其能有明顯的抗瘤作用，并且腫瘤組織重量明顯減輕[11]。GPC3是一個對HCC具有高度診斷價值的腫瘤標志物，其檢測不僅利于HCC早期篩查與診斷，同樣對HCC的療效與預后判斷也具較高價值。

2.2　甲胎蛋白(alpha fetal protein,AFP)

AFP是內胚層組織來源的細胞所分泌的一種糖蛋白，其水平在小兒肝母細胞癌及成人肝細胞癌中明顯升高。在60%～80%肝癌患者的血清及腫瘤組織中，AFP的水平明顯升高，使其成為CAR-T細胞免疫治療的理想靶點。 以AFP為靶抗原構建出CAR-AFP-T細胞，并在Hep G2荷瘤小鼠模型上進行驗證，結果發現經血管給藥，約17%的小鼠的瘤體積較對照組明顯較小；經瘤內注射給藥，約75%的小鼠腫瘤完全消退，并且沒有瘤組織殘留[12]。

2.3　CD133

腫瘤干細胞(cancer stem cell,CSC)是一種數量較少的干細胞樣癌細胞亞群，是腫瘤形成的起始細胞，也是腫瘤復發、轉移、放化療抵抗乃至治療失敗的根源。CD133是腫瘤干細胞的新型標志物，在維持干細胞特性上十分重要，且與腫瘤的預后不良相關。相關Meta分析指出，CD133在肝癌病人中顯著表達，且與患者的總體生存率(OS)及無瘤生存率呈負相關[13]。 利用第3代CD133-CAR-T細胞治療惡性多形性成膠質細胞瘤(glioblastoma mulfiform,GBM)有顯著療效，且在血液中能穩定存在，其在動物試驗中能明顯提高動物的總體生存率[14]。目前尚沒有發現以此為靶點構建CAR-T細胞治療肝癌的臨床前實驗，所以CD133可能作為新興腫瘤免疫治療的合適的靶點。

2.4　Notch1

Notch基因編碼一類高度保守的細胞表面受體，Notch信號影響細胞正常形態發生的大多數過程，包括細胞的分化、細胞凋亡及細胞邊界的形成等。在乙肝病毒相關性肝癌中，乙肝病毒X蛋白(HBx)作為致癌因子，通過使Notch信號通路活化而促進肝癌的發生，而使用γ分泌酶抑制劑(GSI)阻斷Notch信號通路發現其能抑制HepG2肝癌細胞的增殖，并將細胞阻滯于G0/G1期，并能誘導肝癌細胞的凋亡[15]。

在肝癌患者中，存在針對許多腫瘤抗原的自發T細胞應答，如針對NY-ESO- 1，MAGE- A10和p53等，但這些T細胞應答并不能殺滅或抑制腫瘤細胞，歸其原因，可能是由于大多免疫抑制的機制是由腫瘤本身所主導。例如許多分子(如MHC)的正常免疫應答會被腫瘤本身所干擾，或是在肝癌患者中CD4 T細胞的損傷為其免疫逃避的主要機制[16]，同時，淋巴細胞群的增加、NK細胞受抑制、免疫檢查點通路的上調也被證實為肝癌患者免疫應答缺失的表現[17]。

3　CAR-T治療出現不良反應及解決措施

CAR-T細胞在對腫瘤的治療過程中也暴露出值得關注的安全問題。

3.1CAR-T細胞在臨床治療中首要問題為“脫靶效應”

如前文所述，在分子靶抗原中，特異性腫瘤抗原很少，大多為腫瘤相關性抗原(TAA)，這些抗原在某些重要臟器表達，由此造成組織臟器損傷、自身免疫性疾病或免疫缺陷。由于肝臟組織存在碳酸酐酶-Ⅸ(carboxy-anhydrase-Ⅸ)，以此為靶點構建CAR-T細胞治療腎轉移癌時，8例患者中有4例患者肝酶升高，在對其肝臟進行穿刺活檢時發現，T細胞彌漫浸潤膽道，在膽管上皮細胞中碳酸酐酶-Ⅸ存在表達的現象[18]。

3.2　細胞因子風暴

CAR-T細胞在殺傷腫瘤過程當中，產生大量的細胞因子，如TNF-α、IFN-α和IL- 1等，從而引發以急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndro-me，ARDS)及多臟器功能衰竭(multiple organ dysfunction syndrome,MODS)為主的“細胞因子風暴”[19]，在使用CAR-T細胞治療結腸癌伴肝轉移及肺轉移的患者時，患者迅速出現ARDS而導致死亡[20]。

除此之外還包括移植物抗宿主病、插入突變、免疫逃避和過敏反應等等，如何解決這些問題也成為CAR-T細胞治療的重要研究內容。

2010年美國重組DNA咨詢委員會回顧了與CAR-T細胞治療相關的不良反應并提出提高安全性的建議：1)引入自殺基因的人工調控開關，必要時通過誘導轉染T細胞的凋亡而減輕對機體的毒性作用，由于自殺基因需要一段時間被激活，故自殺基因系統對慢性毒性反應較為有效。2)輸注劑量由少到多，逐漸加量，在使用第一、二代CAR未出現明顯毒性反應時，再使用下一代CAR，并從小劑量開始，防止速發的毒性反應。3)用2種單鏈抗體(scFv)構建雙靶抗原 CAR，以提高腫瘤靶向性。4)使用小劑量反復輸注CAR修飾中樞記憶T細胞和干細胞樣記憶T細胞，以增加對腫瘤殺傷的特異性及減少對正常組織的損傷。

4　結語與展望

原發性肝癌如同大多實體性腫瘤，其細胞內信號傳導為多條路徑、多種因素和復雜交叉的網絡系統，對其治療靶點的尋找及針對不同靶點設計相關CAR-T細胞對于其治療有著重要意義。CAR-T對于原發性肝癌的治療受到更多的關注，并且在臨床前期及臨床試驗中取得了一些成果，但是在對于實體瘤的治療當中，仍存在著很多問題。例如如何提高CAR-T細胞遷移到實體瘤內發揮殺傷功能的能力，同時，即使CAR-T細胞遷入到實體瘤內，T細胞將面臨有嚴重免疫抑制作用的腫瘤微環境，如何解決這些問題對于CAR-T細胞治療原發性肝癌等實體瘤至關重要。 筆者認為，以后的研究中要致力于如何增強對抗腫瘤免疫抑制環境的能力、如何增強CAR-T細胞遷移到腫瘤部位的能力及尋找更多實體瘤的特異性靶抗原，同時也需要大量的臨床前實驗及多中心臨床資料明確對于實體瘤治療過程中，CAR-T細胞回輸時機、次數、劑量和如何有效評估其治療效果等，不斷地減少不良反應的發生，提高患者生存質量，相信CAR-T技術將為原發性肝癌患者治療帶來新的希望。