甜瓜果長基因fl與性別表達基因a的遺傳分析及定位

范文林，王賢磊，李群，俞志杰，李冠

(新疆大學生命科學與技術學院，烏魯木齊 830046)

0 引 言

【研究意義】2015年中國甜瓜種質面積691.35萬畝，產量1 527.10萬噸，占世界甜瓜的35.66%和48.6%《中國農業統計資料(2015)》。在過去的20年中，我國甜瓜產量增加了29%，種植面積增加了8%[1]。現代市場對甜瓜的需求趨向多元化，尤其是果實形狀時常影響著人們的消費趨向[2]。果實形狀在甜瓜中是一個有價值的性狀，在甜瓜中開展對果實形狀開展遺傳與定位研究十分必要。目前甜瓜中大多數育種材料為雄花兩性花同株，使甜瓜雜交育種工作中因人工去雄而費工費時，增加了雜交種成本，還常因去雄不完全，導致種子純度降低，使優良雜交種推廣受到影響[3]。要解決這些問題，需要在生產中培育出雌雄異花同株的甜瓜母本。通過分子手段對甜瓜雌雄異花同株基因進行定位，是實現快速、高效培育雌雄異花同株甜瓜母本的基礎。【前人研究進展】在植物界，果實是最晚進化出的器官之一[4]。一些果實類植物(如番茄、西葫蘆等)的果實形狀和果實大小存在很大的差異[4]。比如在甜瓜(CucumismeloL.)中，C.meloVar. agrestis中果實一般4 cm長，而C.meloVar. Flexuosus中的果實一般2 m長[5]。先前的研究已經發現果實發育是受嚴格的遺傳控制[6,7]。Sinnot研究發現西葫蘆的果形遺傳受雙基因控制[8]。而大多數植物的果形遺傳是受多基因控制的，比如黃瓜(Cucumissativus)[9]、甜瓜(C.melo)[10,11,12]、番茄(Lycopersicon)[13,14]和辣椒(Capsicum)[15,16]。2004年，Monforte等證明了甜瓜果實形狀受嚴格的多基因遺傳控制[17]。2007年，Eduardo等發現甜瓜果形的“基因與環境互作效應”是很低的，遺傳力很高[18]。甜瓜的性別表達主要受三對基因(a，g和gy)的控制[19-23]。其中，A_G_基因型是雌雄異花同株；aaG_基因型是雄花兩性花同株；A_gg 基因型是雌花兩性花同株；A_gggygy 基因型是全雌花；aagg基因型是雌雄同花[3]。2002年，Perin等[4]發現控制甜瓜雌雄異花同株、雄花兩性花同株的性別表達基因a只位于2號連鎖群。2010年，劉威等[24]發現控制甜瓜雌雄異花同株、雄花兩性花同株的性別表達基因a只位于4號連鎖群。半個多世紀以前，國內外學者就開始了對甜瓜果實形狀和性別表達類型(雄花兩性花同株、雌雄異花同株)進行遺傳定位的探索。1967年，Wall[21]通過對甜瓜muskmelon性別表達類型(雄花兩性花同株、雌雄異花同株)及果實形狀的統計及分析，發現性別表達類型受一個單基因控制，等位基因A負責雌雄異花同株的表達，而等位基因a負責雄花兩性花同株的表達；他還發現甜瓜性別表達基因a與果形基因緊密連鎖，雌雄異花同株植株的果實一般較長，而雄花兩性花同株植株的果實偏圓。2002年，Perin等[4]利用兩種長形甜瓜品種PI 161375和PI 414723分別與同一種圓形甜瓜品種vedrantais雜交獲得的兩種RIL群體對果實形狀進行QTL分析，再次證明了甜瓜果實長度的一個主效QTL與性別表達基因a在2號連鎖群緊密連鎖。2005年，Monforte等[25]利用甜瓜Piel de Sapo和12種引進品種作為實驗材料研究甜瓜果實相關性狀的遺傳模式也發現：通常甜瓜的單性花品種的果實一般比雙性花品種的果實要長。2011年，王賢磊等[26]以甜瓜日本安農二號和新疆哈密瓜K413為材料對甜瓜果形性狀進行遺傳定位，發現C2連鎖群上存在FS2.1和FS2.2兩個控制甜瓜果形的QTLs，并且認為該連鎖群上普遍存在控制甜瓜果形的QTLs。2017年，矯士琦等[2]以美國厚皮甜瓜品系ms-5和中國薄皮甜瓜品系HM-1為材料對甜瓜果實和種子相關性狀進行QTL分析，在2號連鎖群也發現了一個控制果實長度的QTL。各種甜瓜品種中2號連鎖群上都普遍存在一個控制甜瓜果實長度的QTL。【本研究切入點】目前國內外關于甜瓜果形的研究都還處在相關QTL定位階段，還未見有關克隆出甜瓜果形基因的報道。另外，目前對于甜瓜2號連鎖群花性型基因a與果長基因的連鎖關系的研究也比較多，但還沒有一個能讓大家普遍接受的研究成果。研究甜瓜2號連鎖群中果長基因fl與性別表達基因a的連鎖關系。【擬解決的關鍵問題】在甜瓜西州蜜和蛇瓜雜交組合的2號連鎖群上，對果實長度基因fl與性別表達基因a進行定位，研究其與性別表達基因a的連鎖關系，為實現在基因水平控制甜瓜果形，培育優良果形甜瓜新品種提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

西州蜜和蛇瓜由新疆國家瓜類工程技術研究中心提供。西州蜜為雄花兩性花同株，果實偏圓形，較短；蛇瓜為雌雄異花同株，果實長條形，偏長。

以短瓜、雄花兩性花同株品種西州蜜為父本，以長瓜、雌雄異花同株品種蛇瓜為母本，二者雜交獲得F1代。F1代再與西州蜜回交獲得BC1代分離群體。2017年5月將170株BC1分離群體種植于昌吉試驗田(87.383°E，44.166°N)，最終利用160株健康BC1分離群體對甜瓜2號連鎖群果實長度基因fl與性別表達基因a進行初步定位。

1.2 方 法

1.2.1 甜瓜基因組DNA的提取

將170株BC1個體種植于田間，20 d后分別取直徑小于5 cm的甜瓜幼嫩葉片樣品，標記后置于冰盒中，于-80℃儲存待用。提取170株BC1個體基因組DNA，基因組DNA的提取方法參照改進的CTAB法[27]。瓊脂糖凝膠電泳檢測提取甜瓜DNA的質量與濃度，將其稀釋至100 ng/μL。

1.2.2 農藝性狀的鑒定

選擇160株健康的BC1個體，對其性別表達類型、果實長度進行鑒定和統計，以對性別表達基因a，果長基因fl進行定位。在甜瓜播種后45 d，對各植株留單瓜授粉并統計BC1群體各植株的性別表達類型。若植株中雌花存在雄蕊，則視為雄花兩性花同株；若植株中雌花不存在雄蕊，則視為雌雄異花同株。在授粉后45 d，用直尺對各個植株留單瓜的成熟果實測量并統計其果長(果實縱徑)。

1.2.3 甜瓜果長性狀與性別類型性狀遺傳規律

將160株健康BC1個體的果實長度數據按照花性型分為雌雄異花同株和雄花兩性花同株兩組，用IBM SPSS statistics 22軟件對兩組數據進行差異顯著性分析，分析兩組之間果實長度的差異、差異的顯著性。

將160株BC1個體的果長數據用IBM SPSS statistics 22軟件繪制頻率分布直方圖，觀察這160株BC1個體果長的頻率分布情況，研究果長的遺傳規律。

將160株BC1個體的性別表達類型統計結果(雄花兩性花同株、雌雄異花同株)用IBM SPSS statistics 22軟件進行擬合優度檢驗，分析這160株BC1個體的性別表達類型統計結果是否符合3:1的遺傳分離比。

1.2.4 甜瓜長、短瓜池之間多態性標記的篩選

根據集團分離分析法(Bulk Segregant Analysis, BSA)，從BC1分離群體的160株個體中隨機選出30個短瓜植株的DNA和30個長瓜植株的DNA，分別等量混合建成短瓜DNA池和長瓜DNA池(1.2.3中雄花兩性花同株和雌雄異花同株兩組之間果實長度差異顯著性分析表明：雄花兩性花同株植株果實較短，雌雄異花同株植株果實較長。即短瓜DNA池為雄花兩性花同株DNA池，長瓜DNA池為雌雄異花同株DNA池)。使用前人報道的2號染色體上19個簡單重復序列(SSR)分子標記引物以及29個新設計的SSR分子標記引物在兩池之間進行PCR擴增，擴增結果通過非變性PAGE電泳，銀染的方法檢測。SSR分子標記的設計如下：采用SSRHunter1.3軟件在SSR標記CMBR041和ECM61區間之內分析所有的SSR位點，選取重復基序總長大于12的位點，在其兩端150 bp范圍之內利用primer premier 5軟件設計新的SSR引物。引物由北京華大基因研究中心合成。

1.2.5 多態性分子標記的檢測

將篩選獲得的多態性SSR分子標記引物對160株BC1個體DNA進行PCR擴增檢測，PAGE電泳，銀染的方法檢測，記錄每個個體的帶型情況。單帶型記為A，雜合帶型記為H。如數據缺失用“-”表示。

1.2.6 果長基因fl、性別表達基因a的初步定位及連鎖圖的構建

將篩選獲得的10個多態性SSR分子標記對160株BC1個體進行檢測，記錄分子標記的帶型情況，獲得基因型數據。使用QTL IciMapping v4.1作圖軟件對獲得的基因型數據進行分析。遺傳連鎖圖的參數設置：首先對10個多態性標記進行分組，分組的算法是LOD值為2.5，最大圖距為50 cM。在10個多態性標記正確分組后，以nnTwoOpt命令對標記進行排序。初步排序后，以連鎖群為單位重排標記。重排參數為相鄰距離之和，染色體越短，重排效果越好。最后輸出作圖結果。

2 結果與分析

2.1 甜瓜果長性狀與性別表達類型性狀的遺傳規律

160株BC1群體中雄花兩性花同株和雌雄異花同株兩組果實長度數據進行成組數據的t檢驗的結果顯示，160株BC1群體中有112株雄花兩性花同株植株，48株雌雄異花同株植株。所有雄花兩性花同株植株的果實長度平均值為15.36 cm，所有雌雄異花同株的果實長度為16.58 cm，兩組果實長度數據之間存在極顯著的差異。表1

表1 160株BC1個體中雄花兩性花同株與雌雄異花同株兩組果實長度數據的差異顯著性

Table 1 The difference significance analysis of fruit length between andromonecious and monoeciousgroupin160BC1plants

性別表達類型Sex expression type植株數Number of plants果實長度均值Average of fruit length標準偏差Standard difference標準誤差平均值Average of standard error雄花兩性花同株Andromonoecious11215.361.80.17雌雄異花同株Monoecious4816.58**1.930.28

160株BC1個體果長數據繪制的頻率分布直方圖顯示，圖中160株BC1個體果實長度分布呈現單峰，且為連續性變異，在西州蜜和蛇瓜的雜交組合中，果實長度的遺傳為QTL遺傳。圖1

BC1個體性別表達類型數據符合3∶1的擬合優度檢驗的結果為，雄花兩性花同株與雌雄異花同株分離比的卡方值為0.133，大于0.05，故差異不顯著，即160株BC1個體中，雄花兩性花同株與雌雄異花同株的分離比符合3∶1的分離比。表明在西州蜜和蛇瓜的雜交組合中，雄花兩性花同株與雌雄異花同株的遺傳不受單基因控制，推測其可能受雙基因的遺傳控制。表2

圖1 160株BC1個體的果實長度頻率分布

Fig.1 The distribution histogram of fruitlengthin160BC1plants

表2 160株BC1個體性別表達數據3∶1卡方檢驗結果

Table 2 The 3∶1 Chisquare test result of sex expression type (andromonecious, monoecious)in160BC1plants

性別表達類型Sex expression type觀測的植株數Number of plants observed預期的植株數Number of plants expected殘差Residual雄花兩性花同株Andromonoecious118120-2雌雄異花同株Monoecious42402合計Sum1601600卡方 Chi-square自由度 Degree of freedom漸近顯著性 Progressive significance0.13310.715

2.2 多態性標記的篩選

用共計48個SSR標記(前人報道的19個和自己設計的29個)在長、短瓜池之間篩序得到了10個多態性的SSR標記，多態率為20.8%，這10個多態性SSR標記的詳細信息為，其中35號標記CMGA36、36號標記CMBR041、40號標記ECM61三個標記已有定位報道，這三個SSR標記可以作為錨定位點將研究建立的2號連鎖群與國際上發表的其他遺傳圖的2號連鎖群相對應。圖2，表3

注：M表示500 bp marker；34-52為19對前人報道的SSR引物在長、短瓜池(雌雄異花同株、雄花兩性花同株池)的電泳結果；2-1-2-31為29對新設計的SSR引物在長、短瓜池(雌雄異花同株、雄花兩性花同株池)的電泳結果；對勾表示為長、短瓜池之間多態性條帶的SSR標記

Note: M denotes 500 bp marker; 34-52 denotes the eletrophoresis result between the long fruit DNA pool(monoecious DNA pool) and the short fruit DNA pool (andromonoecious DNA pool) of 19 pairs of SSR primers that has been reported; 2-1-2-31 denotes the eletrophoresis result between the long fruit DNA pool and the short fruit DNA pool of 29 pairs of newly designed SSR primers; a tick denotes the SSR marker with the polymorphic bands between the long fruit DNA pool and the short fruit DNA pool

圖2 聚丙烯酰胺電泳檢測多態性的SSR標記

Fig.2 The polymorphic SSR markers detected by polyacrylamide gel electrophoresis

表3 10個多態性SSR標記的信息

Table 3 The information of 10 polymorphic SSR markers

標記編號Number of marker標記名稱Name of marker上游引物Forward primer下游引物Reverse primer2-9SSRl27156ATAAGGCAAAAGGAAATCTAATCTATGTTAAATCAAAGGG2-11SSRl32201AAATGGTTTGGTATACTGAAGAGGAAGTCATAAAACTAAAAT2-12SSRl35092TGATCTTTCCGTAGTTGATACGTCTATTCTCCGTGTTGTA2-17SSRl47159AAAATTGGAGATTCTAAAGGAGATGAAATCAATAAGGCAC2-19SSRl52089TCAAATCCTAAACCCTAAACATGCACCTACTTGTTGTTGT2-21SSRl58093TGCCCAATGTTCATCTTTAACGAGCTAGTGTTTGCTGTCA2-23SSRl61100GTCAGTGGAACTACCAACCCTACCAAAATAATGTCAAGAG35CMGA36[4]TACATTATGGGTAAGGTAAGCCATCTCTTAACTTTCTCTC36CMBR041[28]GTACCGCCTAGGGTTTCTCCCGAGGAAGAGAGAGAAGGGG40ECM61[29]TTTCAAAAAGCGAACCAGCTATCGGACTCGATTACCAAACA

2.3 多態性分子標記的檢測

將篩選獲得的10個多態性SSR分子標記對160株BC1個體進行檢測，所獲得帶型結果只有雜合帶“H”和單帶型“A”，符合遺傳規律。如圖3所示為2-17號標記SSR247159對BC1群體部分個體的PAGE電泳結果。

注：M表示500 bp marker; 1～96為1到96號BC1個體的PAGE電泳結果

Note: M denotes 500 bp marker; 1-96 denotes the PAGE result of 1-96 BC1plants

圖3 2-17號標記SSR247159對BC1群體的個體檢測

Fig.3TheindividualdetectioninBC1ofmarkerSSR247159

2.4 果形基因fl與花性型基因a的QTL分析及連鎖圖的構建

分別針對果實長度性狀、性別表達性狀，結合表型數據與基因型數據，用QTL IciMapping v4.1軟件進行QTL分析，獲得二者的QTL分析圖，對于性別表達類型(雄花兩性花同株、雌雄異花同株)的LOD變化，標記SSR227156和標記CMGA36之間對應的LOD值顯著大于2.5，而且標記SSR232201處的LOD值超過了10，表明在此區間內非常可能存在一個控制甜瓜性別表達類型(雄花兩性花同株、雌雄異花同株)的QTL。對于果實長度的LOD變化，標記SSR247159和標記SSR252089之間的LOD值大于2.5，但區間內的LOD值僅略高于2.5，表明該區間可能存在一個控制甜瓜果實長度的QTL。圖4

通過QTL IciMapping v4.1軟件，結合果實長度性狀、性別表達類型的表型數據與10個標記的基因型數據，獲得了包含2號連鎖群8個多態性標記的連鎖圖，圖中顯示，兩端標記SSR258093、ECM61與相鄰標記之間的遺傳距離大于30 cM，需要舍棄。在該連鎖圖中，這8個多態性標記跨越27.31 cM的遺傳距離，兩個標記間平均遺傳距離為3.41 cM。在該連鎖圖中，性別表達類型QTL命名為a，定位在標記SSR227156和標記CMGA36間，遺傳距離為3.59 cM；果實長度QTL命名為fl，定位在標記SSR247159和標記SSR252089間，遺傳距離為3 cM；兩區間之間的遺傳距離為0.6 cM。圖5

注：用十個多態性SSR標記在BC1分離群體的基因型數據結合果長、性別表達類型數據用QTL IciMappping v4.1 對二者進行QTL分析

Note: the QTLs associated with fruit length and sex expression type were identified basing on genotype data of 10 polymorphic SSR markers and phenotype data for the two traits in BC1in QTL IciMapping v4.1

圖4 甜瓜果實長度與性別表達類型(雄花兩性花同株、雌雄異花同株)QTL

Fig.4 The QTL analysis of fruit length and sex expression type in melon

注：圖中空心長棒表示2號連鎖群；長棒延伸線左側表示兩標記的區間，右側表示各個標記的名稱；黑色實心圓表示性別表達類型基因a可能的位點，黑色實心三角表示果長QTL可能的位點；a 表示andromonecious，FL表示Fuit Length

Note: the long hollow stick denotes Linkage Group 2; the intervals between two markers are shown on the left of the extened line through the Linkage Group 2, the names of the markers are shown on the right of the extended line; the black solid circle indicates the most likely position of sex expression type genea, the black solid triangle indicates the most likely position of fruit length QTL; a denotes andromonecious, FL denotes Fruit Length

圖5西州蜜與蛇瓜BC1分離群體2號連鎖群

Fig.5TheLG2linkagemapofBC1derivedfromXIZHOUMIandsnakemelon

3 討 論

研究對西州蜜和蛇瓜BC1分離群體果實長度、性別表達類型(雄花兩性花同株、雌雄異花同株)的遺傳分析表明：果實長度的遺傳為QTL遺傳，這與前人的研究成果一致[10-12]；性別表達類型(雄花兩性花同株、雌雄異花同株)的遺傳受雙基因遺傳控制，這與Perin[4]、李威[24]發現性別表達基因a為單基因遺傳是不同的。但研究定位的一個性別表達基因a位于2號連鎖群這一結果是與Perin[4]定位結果一致的。至于另一個性別表達基因，研究團隊后期將在西州蜜和蛇瓜BC1分離群體其他連鎖群進行定位，驗證另一基因是否如李威[24]的結果位于4號連鎖群，以證實性別表達類型(雄花兩性花同株、雌雄異花同株)受雙基因遺傳控制。在甜瓜中，一般雌雄異花同株植株果實長度較雄花兩性花同株植株的果實長度要長[4,21,25]，這一現象在研究中也發現了。研究對果實長度基因fl和性別表達基因a的定位結果也表明二者處于緊密連鎖的兩區間，這可能是導致該現象的原因。

研究構建的2號連鎖群的連鎖圖由8個SSR標記構成，跨越27.31 cM的遺傳距離，兩標記間平均遺傳距離為3.41 cM。在篩選出的10個多態性SSR標記中CMGA36[4]、CMBR041[28]和ECM61[29]三個標記已有定位報道。由于在構建的連鎖圖中舍棄了ECM61，所以只有標記CMBR041和標記CMGA36可以作為錨定位點將本研究建立的2號連鎖群與國際上發表的其他遺傳圖的2號連鎖群相對應。

Wall[21]曾認為果形性狀與花性型性狀(雌雄異花同株與雄花兩性花同株)是受一個復雜基因中緊密連鎖的兩個亞單元控制。2002年，Perin等的研究中[4]所作的遺傳連鎖圖中，將性別表達基因a與果長QTLFl2.1共定位在2號連鎖群的標記E40/M34_6與CMGA36之間，且兩標記之間的遺傳距離為25.2 cM。在研究獲得的連鎖圖中，果實長度QTLfl定位在標記SSR247159和標記SSR252089之間，遺傳距離為3 cM；性別表達QTLa定位在標記SSR227156和標記CMGA36/SSR235092之間，遺傳距離為3.59 cM；兩區間之間的遺傳距離為0.6 cM。由于研究只有一個錨定標記CMGA36與Perin的標記相一致，且兩基因的定位區間分別位于標記CMGA36的兩側，所以無法確定研究對兩基因的定位哪一種是在C. Perin等定位區域之內。但研究將果實長度基因與花性型基因a初步定位于2號連鎖群遺傳距離分別為3 cM，3.6 cM的兩個區間，定位區間更加精細，且兩區間緊密連鎖，遺傳距離為0.6 cM。

由于目前甜瓜的育種材料大多數為雄花兩性花同株類型[3]，如果需要獲得F1雜交種就需要投入大量的勞動力在繁瑣的人工去雄上[30]，這無疑增加了生產的成本。因此，有必要對具有優良性狀甜瓜品種培育雌雄異花同株品種，從而避免自交的發生，節約成本。研究獲得的針對性別表達基因a的緊密連鎖標記SSR227156和標記CMGA36，可以在未來應用于分子輔助育種培育雌雄異花同株品種。

研究針對果實長度QTL初步定位在2號連鎖群的標記SSR247159和標記SSR252089之間，遺傳距離為3 cM。2015年盧浩等對甜瓜‘PMR6’抗白粉病基因的定位研究中將甜瓜抗白粉病基因pm-PMR6-1初步定位于12號連鎖群的9.1 cM的區間內[31]。研究可參照盧浩等的方法進一步對該果實長度基因進行精細定位，在未來用分子輔助育種手段選育優良果形甜瓜新品種。

4 結 論

4.1 在西州蜜和蛇瓜雜交組合中，果實長度的遺傳為QTL遺傳，性別表達類型(雌雄異花同株、雄花兩性花同株)不只受單基因控制，可能受雙基因遺傳控制。在性別表達類型(雄花兩性花同株、雌雄異花同株)遺傳中，雌雄異花同株對雄花兩性花同株為顯性。

4.2 在西州蜜和蛇瓜的BC1群體中，將果實長度基因fl定位在2號連鎖群標記SSR247159和標記SSR252089之間，遺傳距離為3 cM；性別表達基因a定位在2號連鎖群標記SSR227156和標記CMGA36/SSR235092之間，遺傳距離為3.59 cM；兩區間之間的遺傳距離為0.6 cM。證明二者不是同一基因。