焦瑞蓮,任毓忠,李志強,董海濤,武剛,張莉,李國英,
(1.石河子大學農學院/新疆綠洲農業病蟲害治理與植保資源利用自治區高校重點實驗室,新疆石河子 832003; 2.石河子開發區石大惠農科技開發有限公司,新疆石河子 832003; 3.新疆生產建設兵團第一師農科所,新疆阿拉爾 843300)
【研究意義】棉鈴病害是棉花上的一類重要病害,棉花紅粉病是棉鈴病害中分布較廣的鈴病之一,世界各棉區都有發生,在我國各棉區也有分布。以往在新疆棉區發生很輕,但近年來發生有加重之勢,并常和其它鈴病混合發生。研究紅粉病的病原及其氣候條件對病菌生長、產孢量和分生孢子萌發的影響,對該病的防治具有重要的作用。【前人研究進展】棉鈴紅粉病是由粉紅聚端孢菌Trichotheciumroseum引起,該菌為腐生或弱寄生菌,可引起果蔬紅粉病,如:蘋果、厚皮甜瓜、葡萄、棗果、穗醋栗、西紅柿、菜豆等;還可引起黃麻、棉鈴等至少15種植物紅粉病害。Richard等[1]研究發現一定劑量的粉紅聚端孢的毒性產物可致老鼠、家兔和幼豬死亡,同時,若將毒性產物注射到動物真皮時,可造成動物真皮壞死。該菌于1809年在德國柏林首次被Link發現,1902年Eustace在紐約蘋果上發現紅粉病,隨后在世界各地不斷出現該病害報道。如Shamsi等[2](2008)在孟加拉發現黃麻紅粉病害;Yun等[3](2013)在韓國發現番茄紅粉病;Hamid等[4](2014)在巴基斯坦發現T.roseum可導致番茄、橙子和蘋果果腐等。在國內,戚佩坤(1966年)等報道了黃瓜紅粉病;章戰華[5](2007)對棉花、葡萄、蘋果、甜瓜、香梨、油菜、茄子、草莓上的紅粉病菌進行了研究;王勇等[6](2008)報道了番茄上紅粉病;潘月敏等[7,8](2005)和黎鴻慧等(2011)報道了棉花紅粉病,嚴重發生時可使棉花減產10%。馮中紅等[9](2015)報道了菜豆紅粉病;楊濟徽等(2016)[10]報道了龍眼紅粉病;均由T.roseum引起。但對氣候條件對菌絲生長、產孢和孢子發芽的影響缺乏研究。另外,從近期報道的資料來看,對其學名多用Trichotheciumroseum,但有的書中用Cephalotheciumroseum,有的甚至把它們作為為害棉鈴的兩種菌[11]。【本研究切入點】根據前人研究的結果和新疆對其缺乏研究的實際情況,有必要對新疆棉鈴紅粉病進行較為系統的鑒定。研究結合氣象因子對病菌生長、產孢和孢子萌發的影響。【擬解決的關鍵問題】研究新疆棉花紅粉病的病原,明確氣象因子與病菌生長、產孢和孢子萌發的關系。分析新疆棉鈴紅粉病菌的病原及其生物學特性,為制定有效的防治提供理論依據。
2017年分別于8和9月,對北疆石河子棉區150團4連和9連、147團19連、142團23連、133團20連,以及南疆阿克蘇棉區12團、阿瓦提縣、塔河種業等地一些棉田的棉鈴紅粉病害進行調查。共采集典型癥狀的病樣19份,供分離鑒定,對田間癥狀和接種后的癥狀進行觀察、描述和拍照。
1.2.1 病菌的分離、純化及代表性菌株的選擇
在分離前將所要分離的病鈴流水沖12 h,取下,晾干表面水分。用解剖刀切取5 mm×5 mm的病斑,分別在70%酒精中15s和0.1%升汞中停留2~5s、無菌水沖洗3次、置于吸水紙上將水分吸干后,在無菌條件下移植于PDA平板上,將平板置于28℃培養箱中。1~2 d待長出菌落,挑取邊緣菌絲于新的PDA培養基上,繼續培養。共分離出96個菌株,待培養3~4 d左右根據形態特征選出16個代表性菌株進行單孢分離純化。表1
1.2.2 病原鑒定1.2.2.1 形態學鑒定
將單孢分離的16個代表性菌株在PDA培養基上培養7 d后,觀察菌落顏色和形態,并鏡檢其分生孢子形態及顏色;測量孢子大小。采用玻片培養法,25℃下,培養6 d,觀察分生孢子梗的形態及分生孢子在分孢梗頂端的著生狀態。并拍照,作為病原鑒定的主要形態學依據。用測微尺測量50個孢子和孢子梗的大小。
表1 菌株編號及來源
Table 1 The strain ideutifiers and sources origin

編號Identifier采樣地點Origin棉花品種Cotton variety采集時間Collecting time1150團4連紅州1022017.8.232150團4連新陸早61號2017.8.233150團9連新陸早62號2017.8.234147團19連新陸早72號2017.8.235147團19連79號品系2017.8.236147團19連新陸早72號2017.8.237147團19連新陸早62號2017.8.238142團23連新陸早64號2017.8.229142團23連石惠13號2017.8.2210133團20連SH-9品系2017.8.2011133團20連新陸早50號2017.8.2012133團20連新陸早50號2017.8.2013阿克蘇地區塔河種業新陸中37號2017.9.2114阿克蘇地區阿瓦提縣新陸中37號2017.9.1715阿克蘇地區阿瓦提縣新陸中37號2017.9.1716阿克蘇地區12團J206-52017.9.24
1.2.2.2 分子生物學
將供試的16個單孢菌株在PDA平板上培養7 d后,用刀片刮取菌絲體,用Bio Flux試劑盒提取供試菌株的基因組DNA。將提取的DNA置于-20℃冰箱中保存,備用。以提取的菌株基因組DNA為模板,用真核生物rDNA-ITS區通用引物ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)進行PCR擴增,用1%的瓊脂糖凝膠檢測擴增結果,后用回收試劑盒回收純化擴增產物(DNA回收試劑盒)。回收產物經連接轉化后,篩選出具有代表性的陽性克隆,送上海生工(Sangon Biotech)公司測序。將所測得的序列利用Gen Bank BLAST進行同源性比對,并在NCBI核酸數據庫中下載其他相關病菌的ITS區序列,用DNAMAN 8.0軟件進行序列的比對并構建系統發育樹,分析菌株間的親緣關系。
1.2.2.3 致病性鑒定
分別采用菌絲塊接種和噴霧接種兩種方法進行。
菌絲塊接種:在棉田隨機選取健康、大小均勻的棉鈴,用70%酒精擦拭后再用無菌水沖洗3次,供接種用。分有傷和無傷接種于準備好的棉鈴上,每菌株接種3個棉鈴,并取不接種棉鈴作為對照,將其置于保濕缸中室溫下觀察,并記錄其發病情況和癥狀表現,7 d后結束并拍照。
孢子懸浮液接種:按常規方法配置孢子懸浮液(1×106cfu/mL),裝入小型噴霧器內,分別在室內和田間進行噴霧接種,室內接種條件同菌絲塊接種,田間接種為自然條件下田間棉株上的棉鈴,均以不接種棉鈴為對照,觀察并記錄其發病情況及癥狀,7 d后結束并拍照。同時對發病株進行再分離,觀察再分離菌株與接種菌株的異同。
1.2.3 氣候條件對供試菌株生長及產孢量影響1.2.3.1 溫度
按1.2.2.3的方法制取菌餅,將其移植到PDA培養基平板中央,分別在5、10、15、20、 25、30、35和40℃ 8個梯度的培養箱中恒溫培養,3次重復,并分別于24、48、72、96、120、144和168 h測量菌落直徑,共測量7 d。在第7 d用打孔器打取7 mm的菌餅,并按每毫升無菌水3個菌餅的量置于2 mL離心管中,充分震蕩,洗下分生孢子。用血球計數板計量分生孢子量,觀察溫度對菌落生長及產孢量的影響。
1.2.3.2 光照
將上述供試菌株菌餅分別移植于PDA培養基上,設置完全光照、12 h光暗交替和完全黑暗3個處理,在 25℃條件下進行培養,每組3次重復,并分別于24、48、72、96、120、144和168 h測量菌落直徑,分生孢子量的計算方法同1.2.3.1。
1.2.3.3 溫度對孢子萌發的影響
用挑針挑取培養7 d的菌落邊緣分生孢子于凹形載玻片上,將載玻片置于相對濕度為100%的培養盒中,并將培養盒分別置于5、10、15、20、25、30、35和40℃的人工氣候箱中黑暗培養,每種溫度均三次重復。每12 h隨機觀察1次各供試溫度中100個分生孢子的萌發情況,48 h結束,共觀察4次。用SPSS 8.0分析溫度對孢子萌發的顯著性。
1.2.3.4 光照對孢子萌發的影響
用挑針挑取培養7 d的菌落邊緣分生孢子于凹形載玻片上,將載玻片置于相對濕度為100%的培養盒中,之后將培養盒分別放于完全光照、完全黑暗和光暗交替的25℃人工氣候箱中。每12 h隨機觀察100個分生孢子萌發情況,48 h結束,共觀察4次。用SPSS 8.0分析光照對孢子萌發的顯著性。
1.2.3.5 濕度對孢子萌發的影響
用挑針挑取培養7 d的菌落邊緣分生孢子于凹形載玻片上,并將載玻片置于40%、60%、80%、100%四個相對濕度梯度的培養盒中;同時挑取分生孢子于無菌水中,蓋上蓋玻片置于培養盒中作為對照,重復3次。培養盒均置于25℃人工氣候箱中黑暗培養,每12 h隨機觀察100個分生孢子萌發情況,48 h結束,共觀察4次。
用SPSS 8.0分析濕度對孢子萌發的顯著性。
研究表明,棉鈴紅粉病危害的棉鈴一般表現為,初期在棉鈴鈴殼或棉鈴縫隙處形成褐色小點,后逐漸擴大成圓形或近圓形,黑褐色病斑,濕度較大時,病斑處初生白色(菌絲體),后呈粉紅色、厚且緊密的霉層。嚴重時霉層可局部或全部布滿鈴面。使棉鈴不能正常吐絮、甚至形成僵鈴、僵瓣,且僵瓣上也會分布有粉紅色霉層、使纖維變為粉紅色或淺褐色(圖1-A:a、b、c)。
致病性測定表明,菌絲塊接種后無論有傷接種還是無傷接種都可使棉鈴發病,但有傷接種比無傷接種發病早,病情也較重。接種48 h后在棉鈴接種處出現褐色小點,后褐色區域逐漸擴大呈圓形或近圓形、下陷的黑褐色病斑,濕度大時在病斑中心長出白色粉狀物,隨著病斑的擴大,霉層擴增,顏色加深,呈粉白色或粉紅色(圖1-B:b、c)。用孢子懸浮液進行室內離體棉鈴噴霧接種16 h后,棉鈴表面出現水浸狀褐色小點,后不斷擴大成黑褐色斑點;若田間接種,發病較遲,第4 d出現水浸狀褐色小點;而室內、田間沒接種對照棉鈴均不發病。將接種后的病鈴進行再分離, 得到與接種菌株形態相同的病原物。圖1

注:A田間癥狀:a、b田間病鈴癥狀;c棉纖維感染癥狀;B人工接種癥狀:a噴霧接種癥狀;b菌絲塊接種癥狀; c后期癥狀
Note: A field symptoms:a, b: cotton boll symptom in field; c: symptoms of cotton fiber infection; B artificial inoculation symptom:a: spray inoculation symptom; b: symptoms of hyphae block Inoculation; c: the late symptoms
圖1 棉鈴紅粉病田間與接種癥狀
Fig.1 Field and inoculation symptoms of cotton boll red powder disease
將單孢分離純化的16個菌株移植到PDA培養基上,置于28℃恒溫培養箱中培養。第1 d長出淺白色氣生菌絲;第2 d出現少量分生孢子,菌落邊緣呈淺白色;第3 d,由于菌落上產生大量分生孢子,菌落開始呈現粉紅色;后菌落邊緣呈不規則齒狀或波狀,有的具明顯的同心輪紋,菌落正面為粉紅色,背面為粉黃色,邊緣淺白色(圖2-A、B)。由小室培養進行鏡檢,分生孢子梗直立不分枝,具幾個隔膜,長50~200 μm,平均132.75 μm。分生孢子單生或聚生于分生孢子梗頂端,無色,聚集時呈粉色,梨形或卵圓形,雙孢,中間隔膜處稍溢縮,孢基有一偏向乳頭狀突起,大小為(12.5~22.5)μm×(5~12.5)μm,平均大小為16.7μm×8.8 μm(圖2-C、D)。孢子萌發時芽管可從分生孢子基部、頂部、側面等部位萌發,可一端或兩端同時萌發,芽管分支或不分支(圖2-E)。經形態學鑒定該病病原為粉紅聚端孢菌(Trichotheciumroseum)。圖2

注:A、B菌落形態;C分生孢子梗;D分生孢子;E 孢子萌發
Note : A/B Colony morphology;C Conidiophores;D Conidia;E Spore germination
圖2 棉鈴病原菌形態特征
Fig.2 Morphological characteristics of cotton boll pathogenic fungus
提取16個供試菌株DNA,利用rDNA-ITS區引物ITS1/ITS4進行PCR擴增,擴增片段為611~613 bp,對擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測并回收DNA,將回收的DNA做連接、轉化,篩選陽性單克隆菌斑進行培養,后送上海生工生物公司測序。對所測得的序列在NCBI Blast 中進行同源比對。比對結果表明,1、3~10、13~16菌株與T.roseum(KP317992.1) 相似性為100%;2、11與T.roseum(JQ898156.1)的相似性為100%,而12與T.roseum(JQ898156.1) 的相似性達到98%。圖3
通過使用DNAMAN構建系統發育樹發現,其中15個供試菌株與T.roseum都歸在同一分支,只有12不在T.roseum的分支上,但與聚端孢屬(Trichothecium.spp)的其他種如T.ovalisporum)及F.solani不在同一分支上。在對12號菌株的菌落形態、分生孢子、分生孢子梗分析中發現其與其他15個菌株基本相似;且在NCBI Blast同源比對中與T.roseum(JQ898156.1)的相似性為98%。結合各菌株的形態學特征和NCBI Blast同源比對結果,初步認為供試菌株都為T.roseum。圖4

注:M 標準DL 2000 bp;C陰性對照;H1-H16供測菌株
Note: M Molecular size marker DL,2000 bp,C Negative control;H1-H16 Test strain
圖3 供測菌株rDNA-ITS區PCR擴增
Fig.3 PCR amplification in the rDNA- ITS region of the test strain

圖4 供試菌株與相似種的ITS序列發育樹
Fig.4 ITS sequence Phylogenetic tree of the pathogen and similar species
2.4.1溫度條件對病菌生長及產孢量的影響
研究表明,溫度對T.roseum的菌落生長有顯著的影響,該菌在5和40℃不生長,10和35℃生長極其緩慢,其生長的最適溫度是25℃左右。10和35℃菌落均小于2.5 cm。對生長168 h菌落上的分生孢子進行產孢量檢測,以25℃條件下生長的菌落的分生孢子量最多,達到了8.65×106cfu/mL,其次是在20℃時的分生孢子量,而15和30℃的分生孢子量明顯減少,分別為1.75×106cfu/mL和1.9×106cfu/mL;10℃以下和35℃以上不產孢或產孢極少。表2,圖5
表2 不同溫度條件下棉鈴紅粉病菌菌落生長及產孢量變化
Table 2 Effects of different temperatures on colony growth and sporulation capacity of cotton boll pathogenic fungus

溫度Temperature(℃)菌落直徑 Colony diameter (cm)24 h48 h72 h96 h120 h144 h168 h產孢量Sporulation capacity(cfu/mL)50.000.000.000.000.000.000.000.00100.000.000.100.200.420.731.000.00150.000.150.721.432.072.833.451 750 000200.080.771.832.984.235.176.473 175 000250.431.432.633.725.036.387.058 650 000300.271.031.872.583.524.084.501 900 000350.000.030.190.320.470.580.620.00400.000.000.000.000.000.000.000.00

圖5 不同溫度下棉鈴紅粉病菌的菌落形態
Fig.5 Colony morphology of cotton boll pathogenic fungus at different temperatures
2.4.2 光照條件對菌落生長及產孢量的影響
研究表明,在三種光照處理條件下,對T.roseum的生長沒有明顯的差異,但是對產孢量的影響很大,其中以完全光照產孢量最少,為1.85×106cfu/mL;完全黑暗產孢量最大,為8.93×106cfu/mL;光暗交替處于兩者之間,其產孢量為5.63×106cfu/mL。光線對產孢有明顯的抑制作用。不同光照條件對菌落的形態特征也有明顯影響,完全光照和完全黑暗所長出的菌落不產生輪紋;而光暗交替條件下所長出的菌落,由于光暗條件產孢量的明顯不同,則產生明顯的輪紋。表3,圖6
表3 不同光照條件下棉鈴紅粉病菌菌落生長及產孢量變化
Table 3 Effects of different illumination on colony growth and sporulation capacity of cotton boll pathogenic fungus

光照Light菌落直徑 Colony diameter (cm)24 h48 h72 h96 h120 h144 h168 h產孢量Sporulation capacity(cfu/ml)完全光照Light0.451.723.074.335.556.677.451 850 000完全黑暗Darkness0.631.983.384.756.127.087.808 925 000光暗交替Light dark alternation0.651.732.923.985.176.157.225 625 000

圖6 不同光照條件下菌落形態
Fig.6 Colony morphology under different light conditions
2.4.3 溫度條件對孢子萌發的影響
不同溫度對T.roseum的分生孢子萌發具有顯著影響。試驗表明,小于5℃和大于40℃時該菌的分生孢子不能萌發;在10~35℃孢子都可萌發,其萌發的最適溫度為20~25℃,48 h時其萌發率為94%~97.67%,15℃以下和35℃以上萌發率明顯下降。表4
表4 不同溫度條件下棉鈴紅粉病菌孢子萌發變化
Table 4 Effect of temperature on spore germination of cotton boll pathogenic fungus

溫度Temperatur(℃)萌發率 Germination rate (%)12 h24 h36 h48 h5℃0b0d0f0f100b0d0f9e150b13.0c35.5d42.0c2023.7a63.7a86.3b94.0a2525.7a68.7a93.0a97.7a3024.7a47.3b76.3c87.7b350b3.0d7.0e25.0d400b0d0f0f
注:數據后小寫英文字母為0.05水平顯著性差異
Note: little letters after date indicate at 0.05 levels
2.4.4 光照條件對孢子萌發的影響
研究證明,在供試三種條件下T.roseum的孢子均可萌發,且萌發率都較高。在光暗交替和完全黑暗條件下,孢子萌發率均可達到93.33%以上,完全光照條件下孢子萌發率低于其他兩種條件下的萌發率,為85%。完全光照條件對棉鈴紅粉病菌T.roseum的分生孢子萌發具有一定的抑制作用,而完全黑暗和光暗交替則有利T.roseum的孢子萌發。表5
表5 不同光照條件下棉鈴紅粉病菌孢子萌發變化
Table 5 Effect of light on spore germination of cotton boll pathogenic fungus

光照Light萌發率 Germination rate (%)12 h24 h36 h48 h完全光照Light3.8b26.4b59.7b85.0b光暗交替Light dark alternationt3.7c27.6b62.7b93.3a完全黑暗Darkness9.0a40.2a74.0a95.7a
注:數據后小寫英文字母為0.05水平顯著性差異
Note: letters after date indicate at 0.05 levels
2.4.5 濕度條件對孢子萌發的影響
研究表明,在供試的四個相對濕度和水中,48 h后,在100%相對濕度下孢子萌發率為100%;相對濕度在80%時孢子萌發率為80.33%;相對濕度為60%時的萌發率為51.5%;相對濕度為40%時孢子萌發率最低為28.50%;而水中的孢子萌發率為58.7%,與相對濕度60%條件下接近。在40%~100%的相對濕度條件下,濕度越大,孢子的萌發率越高。表6
表6 不同濕度條件下棉鈴紅粉病菌孢子萌發變化
Table 6 Effect of humidity on spore germination of cotton boll pathogenic fungus

濕度Humidity萌發率 Germination rate (%)12 h24 h36 h48 h40%7.5a15.0d23.5d28.5e60%10.3a18.0d27.3d51.5d80%10.3a40.7b65.0b80.3b100%9.5a57.0a98.0a100.0a水12.0a25.3c40.8c58.7c
注:數據后小寫英文字母為0.05水平顯著性差異
Note: little letters after date indicate at 0.05 levels
經鑒定,新疆石河子棉區和阿克蘇棉區的棉鈴紅粉病是由粉紅聚端孢菌(T.roseum)所致,這一結果與潘月敏(2005)等[7]及黎鴻慧等(2011)的報道相同[8]。經分子生物學鑒定,在16個代表性菌株中,其中13個菌株與T.roseum(KP317992.1)相似性為100%;2個菌株與T.roseum(JQ898156.1)的相似性為100%,只有12號菌株與T.roseum(JQ898156.1) 的相似性為98%,初步認為在鐘內可能存在生物多樣性。
國內關于棉鈴紅粉病的研究較少,對其學名應用也比較混亂。如當前有的使用Trichotheciumroseum, 但也有的用Cephalotheciumroseum,有的甚至把它們作為為害棉鈴的兩種菌[11]。張中義等[12]在《植物病原真菌學》中就指出Trichotheciumroseum和Cephalotheciumroseum是同物異名。陸家云[13]在所著植物病原真菌學一書中再次強調Trichotheciumlink=CephalotheciumCorda;Trichotheciumroseum=Cephalotheciumroseum,故不能將其作為兩種不同的菌。Cephalotheciumroseum只是Trichotheciumroseum的同物異名,目前國內大部分研究單位都使用Trichotheciumroseum,以此為好。
研究查明,該菌在10~35℃條件下均可生長,但10和35℃時生長極其緩慢,25℃左右為其生長的最適溫度,5和40℃不能正常生長。對生長7 d的菌落進行產孢量檢測,以生長在25℃條件下的分生孢子量最多,達到了8.65×106cfu/mL;其次是在20℃時的分生孢子量;15和30℃的分生孢子量明顯減少;10℃以下和35℃以上不產孢或產孢極少。該結果與Yun等[3]和王勇等[7]研究結果基本一致,不同點為試驗中5℃菌落不能生長,而王勇等研究中5℃條件下148 h時開始生長。
三種光照條件對T.roseum的菌落生長沒有明顯的差異,但是對產孢量的影響很大。其中完全光照條件下產孢量最少,完全黑暗產孢量最大,光暗交替處于兩者之間,說明光線對產孢有明顯的抑制作用;此外,不同光照條件對菌落的形態特征也有一定的影響:完全光照和完全黑暗所長出的菌落不產生輪紋;而光暗交替條件下所長出的菌落,由于光暗條件產孢量的明顯不同,則產生明顯的輪紋。
分生孢子萌發是病菌侵染的前提,研究氣候條件對病菌孢子萌發的作用對了解該病的發生規律和防治都有重要作用。研究表明,該菌的分生孢子萌發最適溫度為20~25℃,15℃以下或35℃以上孢子萌發率明顯下降,萌發時間推遲,而當溫度小于5℃或大于40℃時,孢子不能萌發,這一結論與殷輝等[14]在棗果貯藏期紅粉病菌鑒定及環境因子對其分生孢子萌發的影響結論相似。關于光照對孢子萌發的影響國內報道很少,試驗查明,該菌分生孢子在供試不同光照條件下都可萌發,且48 h萌發率達到了85%以上,但其趨勢為:完全黑暗>光暗交替>完全光照,表明光線對孢子萌發有一定的抑制作用。關于相對濕度對孢子萌發的影響,試驗的結果是:在40%~100%的相對濕度條件下,濕度越大,孢子的萌發率越高,當濕度大于80%時,最適該菌分生孢子萌發,但在水中的萌發率又明顯下降。
由于棉鈴紅粉病菌產孢量很大,發芽率較高,潛育期較短,對濕度條件要求較高,故秋季一旦遇到持續降雨天氣,易造成該病的發生。
經形態學鑒定、致病性測定和分子生物學分析查明,引起棉鈴紅粉病的病原菌是粉紅聚端孢T.roseum。通過氣候條件對菌落生長、產孢量和對孢子萌發的影響查明,棉鈴紅粉菌在10~35℃條件下均可生長,25℃左右為其生長的最適溫度;在黑暗潮濕的條件下,25℃左右的溫度,適于棉鈴紅粉菌產孢;該菌的分生孢子在10~35℃、40%~100%的相對濕度和有光和無光的條件下均可萌發,萌發的最適條件是:溫度為20~25℃、相對濕度80%以上。在此條件下,相對黑暗的環境更有益于孢子的萌發。