哈密瓜種質資源苗期細菌性果斑病抗性鑒定

韓宏偉，劉會芳，韓盛，莊紅梅，佘建華，王強，王浩

(1.新疆農業科學院園藝作物研究所，烏魯木齊 830091；2.新疆農業科學院植物保護研究所，烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】近年來，由燕麥嗜酸菌西瓜亞種(Acidovoraxavenaesubsp.citrulli，Aac)侵染引起的細菌性果斑病[1]在新疆哈密瓜產區為害逐年加重，嚴重制約了新疆哈密瓜產業的持續發展。細菌性果斑病是由國外或區外傳入新疆[2]，可侵染哈密瓜葉片、莖和果實，也可種子帶菌傳播，是一種毀滅性病害。目前，細菌性果斑病在新疆[3,4]、內蒙古[5]等地哈密瓜主產區發生較為普遍，對哈密瓜的種植和生產造成較大影響。楊小麗等[6]在哈密和北疆哈密瓜產區調查發現，輕病田發病率8%～15%，重病田發病率已高達80%以上，哈密瓜受損率5%～15%。生產上主要采用化學防治和生物防治等方法控制該病害的發生為害，尚沒有理想的防治藥劑，且化學防治與環境不友好。種子帶菌是該病害傳播的主要方式，對帶菌種子進行藥劑處理可有效減少病原菌傳播，但仍不能徹底清除種子上的病原菌[7,8]。篩選抗病種質資源，培育和利用抗病品種是控制哈密瓜細菌性果斑病的最根本有效的措施。目前，研究人員多采用苗期室內噴霧法接種，通過調查供試材料植株葉片病斑面積占葉片總面積的比例來統計病情指數，確定不同甜瓜材料之間的抗性，較能準確的反映出不同材料之間的抗性差異。【前人研究進展】胡俊等[9]通過調查研究，發現不同哈密瓜品種溫室人工接種與田間自然條件下的抗病性完全一致，能間接的反映出田間抗性表現。李俊閣等[10]對136份甜瓜材料苗期進行細菌性果斑病抗性鑒定，沒有篩選出免疫的材料，髙抗的材料有14份，中抗材料91份，中感材料25份，感病材料有6份。李威等[2]對新疆的主要的15個哈密瓜品種(品系)、2個籽瓜及15個西瓜品種進行苗期抗病性鑒定，沒有發現抗病品種。張亮等[11]對25份不同甜瓜材料苗期抗細菌性果斑病鑒定，結果表明，沒有高抗和免疫的材料，中抗和中感材料各8份，感病材料9份。【本研究切入點】不同品種對細菌性果斑病抗性存在明顯差異，但不同研究者所采用的接種時期、接種病原菌濃度及抗性分級標準有所區別，不同研究者所鑒定的品種之間的抗性不能直接進行比較。研究篩選出高抗細菌性果斑病的甜瓜資源。【擬解決的關鍵問題】研究采用室內噴霧法接種，用兩種抗性分級標準對17份哈密瓜材料苗期細菌性果斑病抗性進行評價，分析不同分級標準對品種抗性評價的影響，篩選出高抗或免疫的哈密瓜種質資源，為抗病品種選育奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試哈密瓜資源由新疆農業科學院園藝作物研究所提供，共17份，其中自交系材料14份，雜交種3份。接種用細菌性果斑病病原菌(BFB)由新疆農業科學院植物保護研究所瓜類病害研究室提供，該病原菌分離自新疆昌吉州蔡家湖鎮哈密瓜集中種植區甜瓜細菌性果斑病典型病株。表1

表1 供試甜瓜及其來源

Table 1 The name and source of the experimental muskmelon

材料編號Material number材料Material name材料類型Source of materialJM17-1炮臺紅新疆哈密瓜地方品種JM17-2皇后哈密瓜常規種JM17-3JM17-1×JM17-2F1JM17-4K1-1自交系材料JM17-5黃旦子新疆地方品種JM17-6JM17-4×JM17-5F1JM17-7早黃蜜♀自交系材料JM17-8新86♀新疆哈密瓜地方品種JM17-9西州密17號♀自交系材料JM17-10伽師瓜新疆晚熟地方品種JM17-11V4自交系材料JM17-12JM17-10×JM17-11F1JM17-13M1607自交系材料JM17-14K5-6-2自交系材料JM17-15M10-6自交系材料JM17-16M1-2自交系材料JM17-17M1605-1自交系材料

1.2 方 法

1.2.1 鑒定材料準備

供試甜瓜材料幼苗培育在新疆農業科學院園藝作物研究所安寧渠試驗基地進行。試驗所用的甜瓜種子采用干熱法滅菌，具體方法參考周賢達等[12]的方法，即30℃恒溫干燥12 h、65℃干熱滅菌48 h。育苗基質采用進口SOLVIKA Peat Moss，消毒后裝入規格為4×8穴的育苗盤中，每個品種播8穴，每穴2～3粒，播之前澆足水，設3次重復，以感病品種炮臺紅幼苗為對照。分別在出苗后第10、18 d葉面噴施1次營養液，其余時間視基質墑情只澆清水。兩片真葉完全展開時，準備接種。試驗所用器材均用5%的次氯酸鈉溶液浸泡消毒30 min，再用自來水沖洗2遍。

1.2.2 接種菌液制備

將保存的細菌性果斑菌液于NA固體培養基劃線活化培養72 h后，挑取活化的單菌落接種于裝有150 mL NA液體培養基的玻璃三角瓶中，再將接種菌株的三角瓶放于28℃、150 RPM的恒溫搖床中震蕩培養24 h，取少量菌液用紫外分光光度計于600 nm波長條件下測定OD600吸光度值，當菌液OD600吸光度值為0.5時，菌液濃度即可達1×108CFU/mL以上，以該菌液作為接種菌液。

1.2.3 接種

2017年8月在新疆農業科學院植物保護研究所人工氣候室內采用葉面噴霧法接種。將培養的供試甜瓜幼苗移至人工氣候室內，高壓鈉燈補光，設置恒溫30℃，光照12 h，黑暗12 h，適應2 d后開始接種，噴霧接種后，用塑料薄膜覆蓋保濕24 h，創造利于發病條件。接種時以感病材料炮臺紅(JM17-1)葉面噴施等量的清水為空白對照，以接種病原菌的炮臺紅為感病對照。

1.2.4 抗性鑒定及評價標準

接種15 d后，開始調查發病情況。調查時剪去頂部嫩葉，只保留最下部4片真葉，統計病斑與葉片的面積比。分別采用金巖[13]和Hopkins[14]2種分級標準進行發病情況調查。

病情指數(DI)=Σ(各級病葉數×發病級數)×100/(調查總葉數×最高發病級數)。

相對病情指數=鑒定品種平均病情指數/對照品種平均病情指數(病情指數最高者為對照品種)。

相對抗病指數=1-相對病情指數。

采用相對抗病指數來評價其抗病程度[15]，抗病程度分為免疫I(1.00)、高抗HR(0.80～0.99)、中抗MR(0.40～0.79)、中感 MS(0.20～0.39)、感病S(0.20以下)5類。表2

表2 細菌性果斑病病情分級標準

Table 2 Grading standard of bacterial fruit blotch

病情分級Severity level分級標準(金巖,2003)Grading standard (Jinyan,2003)分級標準(Hopkins)Grading standard(Hopkins,2002)0 級無病癥無病癥1 級病斑占葉面積的 1% 以下葉片病斑少,病斑面積占整葉片面積的10%以下2 級病斑占葉面積的 2%～5%病斑較多,病斑面積占整葉面積的 10%～30%3 級病斑占葉面積的 6%～20%病斑較多,病斑面積占整葉面積的 30%～50%4 級病斑占葉面積的 21%～40%葉片病斑很多或融合成大斑,病斑面積占整葉面積的 50%～70%5 級病斑占葉面積的 41% 以上葉片病斑很多或融合成大斑,病斑面積占整葉面積的70% 以上

2 結果與分析

2.1 參試甜瓜材料的抗性

噴霧接種5 d后，感病材料JM17-1和JM17-10的真葉和子葉開始出現水漬狀病斑，接種15 d左右，開始大量發病，病斑多呈圓形或多角形，葉緣起初呈“V”字形，隨時間推移，病斑中間慢慢變薄、干枯(圖1A)，抗病材料JM17-1在接種15 d后只有個別葉片有零星病斑出現(圖1B)。噴清水的感病對照葉片無病斑出現。圖1

17份供哈密瓜試品種(系)之間抗性表現差異顯著。采用金巖等的抗性分級標準，在17份供試材料中，沒有對果斑病免疫的材料，表現高抗的材料有1份，為JM17-14，占供試材料的5.9%；表現為中抗的有11份，占比64.7%，中感材料有3份，占比17.6%；感病材料2份，為JM17-1和JM17-10，占比11.8%。采用Hopkins的抗性分級標準，17份供試甜瓜材料中，沒有對果斑病免疫或高抗的材料，對果斑病抗性最高的為JM17-14，相對抗病指數為0.76，屬于中抗水平。表現中抗的材料共有14份，占供試材料的82.4%，2份材料表現為中感，占比11.8%，感病材料1份，為JM17-1。

供試材料中F1代植株抗性多介于其親本抗性之間。以金巖的抗性分級標準為例，如，JM17-3為JM17-1×JM17-2的F1代，JM17-3的相對抗病指數為0.31，介于其親本JM17-1的0.00和JM17-2的0.54之間。同樣，F1代JM17-6的相對抗病指數介于其親本JM17-4和JM17-5之間。但F1代JM17-12的相對抗病指數為0.60，高于其雙親JM17-10和JM17-11，表現為超親優勢。表1

注：A為感病材料JM17-1接種15 d后的發病情況；B為高抗材料JM17-14接種15 d后的發病情況

Note: A: The morbidity of susceptible cultivar JM17-1 after 15 days of inoculation; B: The morbidity of resistant cultivar JM17-14 after 15 days of inoculation

圖1 甜瓜不同抗性材料接種15 d后的癥狀表現

Fig.1 The morbidity of different resistant material after 15 days of inoculation

2.2 不同的抗性分級標準抗性鑒定

采用2種不同的抗性分級標準對17份供試甜瓜材料進行苗期抗性鑒定，2種抗性分級標準都能將17份供試材料的抗性水平區分開，且其抗性強弱順序基本一致。采用2種抗性分級標準，17份供試材料中，抗性評價一致的有13個，其中JM17-2等11個品種表現為中抗水平(MR)，JM17-1和JM17-9分別表型為感病和中感，有3個品種抗性評價水平不同。同一品種采用Hopkins的抗性分級標準所得的相對抗病指數普遍高于采用金巖的抗性分級標準所得結果。表3

表3 兩種抗性分級標準對17份供試甜瓜材料的抗性鑒定結果

Table 3 Results of identification of resistance toAcidovoraxavenaesubsp.Citrulliamong 17 melon (CucumisSPP.) at seedling stage using 2 grading standard

材料編號 Material number抗病分級標準1(金巖,2003)Grading standard(Jinyan,2003)抗病分級標準2(Hopkins,2002)Grading standard(Hopkins,2002)平均病情指數Average disease index相對病情指數Relative disease index相對抗病指數Relative resistance index抗性分級Evaluation resistance平均病情指數Average disease index相對病情指數Relative disease index相對抗病指數Relative resistance index抗性分級Evaluation resistanceJM17-158.27a1.000.00S46.09a1.000.00SJM17-226.56e0.460.54MR18.32d0.430.57MRJM17-340.25c0.690.31MS20.70c0.490.51MRJM17-421.30f0.370.63MR14.48e0.340.66MRJM17-522.27ef0.380.62MR17.46g0.420.58MRJM17-624.67e0.420.58MR16.53de0.390.61MRJM17-733.48d0.570.43MR20.38c0.500.50MRJM17-830.08d0.520.48MR18.61d0.440.56MRJM17-944.98b0.770.23MS29.74b0.740.26MSJM17-1051.43ab0.880.12S32.63b0.690.31MSJM17-1127.67e0.470.53MR17.78d0.420.58MRJM17-1223.20ef0.400.60MR14.62e0.320.68MRJM17-1334.72d0.600.40MR19.96cd0.480.52MRJM17-148.55g0.150.85HR10.22f0.240.76MRJM17-1538.47c0.660.34MS22.36c0.490.51MRJM17-1631.17d0.530.47MR21.14c0.480.52MRJM17-1720.30f0.350.65MR13.19ef0.270.73MR

3 討 論

3.1 采用室內苗期噴霧法接種進行抗性鑒定，因接種量的大小、濃度、溫度與濕度條件一致，能客觀的反映出不同材料之間的抗性差異[11]。但不同研究者在對甜瓜進行抗細菌性果斑鑒定時，采用的接種菌液濃度及接種時期存在較大差異。如楊小麗等[6]采用的接種菌液濃度為1×105～1×106CFU/mL，接種時期為第4 片真葉完全展開，張亮等[11]接種菌懸液濃度為5×108CFU/mL，在2～4片真葉完全展開時接種，劉欣欣等[16]將菌液濃度調至1×108CFU/mL，在3片真葉時接種。而有研究發現，甜瓜的抗病性不僅取決于自身的抗性，也與接種量、接種菌液濃度、接種時期和接種方法等因素有關[10]；不同研究者所采用的抗性分級標準也不盡相同。較常用的抗病分級標準有2個[13-14](金巖,2003)，(Hopkins,2002)。研究采用這2種分級標準，均能把供試品種資源的抗性區分開，抗性強弱順序基本一致，但采用不同分級標準，對供試品種資源的抗性水平評價存在差異，如研究中供試材料JM17-14，采用金巖的抗性分級標準，可被劃分到高抗水平，而采用Hopkins的抗性分級標準，其抗性水平僅為中抗。

有必要制定甜瓜抗病性鑒定技術標準，通過統一抗性分級標準、接種量、接種菌液濃度、接種時期和接種方法等指標，使不同研究者之間的研究結果具有可比性，則更具有應用價值。

3.2 不同哈密瓜品種資源對果斑病菌(Acidovoraxavenaesubsp.citrulli，Aac)抗性差異顯著。17份供試哈密瓜材料中，沒有對果斑病菌表現免疫的材料，這與李俊閣等[10]、張亮等[11]的研究結果一致。可見，對細菌性果斑病免疫、高抗的甜瓜資源匱乏是限制甜瓜抗病新品種選育的關鍵因素，除了繼續開展抗病資源鑒定、篩選以外，還需要收集、引進野生抗病資源或利用現有高抗材料，精細定位、克隆抗病基因，研究哈密瓜抗細菌性果斑病的分子機制，創制哈密瓜抗病資源，培育抗病品種。

3.3 研究中雜交F1代的抗性多介于其雙親之間，但也有超親優勢存在。不同甜瓜材料配置的雜交組合，表現出不同的抗性，其抗性遺傳規律也不盡相同，可能是甜瓜細菌性果斑病抗性由多基因控制，這與胡俊等[9]的研究結果一致。目前，國內關于甜瓜細菌性果斑病的抗性遺傳機制研究較少，遺傳規律并不清楚。還需要通過構建極端抗病×極端感病的F2和BC1遺傳分離群體，進一步研究哈密瓜細菌性果斑病抗性遺傳規律，為抗性基因定位與挖掘奠定基礎。

4 結 論

苗期室內噴霧法接種，可以用于甜瓜細菌性果斑病抗性鑒定；供試17份哈密瓜材料中，沒有對細菌性果斑病菌表現免疫的材料，表現高抗的自交系材料有1份，為JM17-14，可以用于哈密瓜細菌性果斑病抗性育種及抗性基因定位；采用2種抗性分級標準，供試哈密瓜資源的抗性強弱順序基本一致，但抗性水平評價有差異，即同一供試材料，采用Hopkins的抗性分級標準所得的相對抗病指數普遍高于采用金巖的抗性分級標準所得結果。