核桃葉斑病病菌菌絲體及孢子越冬存活研究

劉金宇，迪麗努爾，賈海英，蔣萍

(新疆農業大學林學與園藝學院，烏魯木齊 830052)

0 引 言

【研究意義】核桃(Juglansregia)為胡桃科(Juglandaceae)胡桃屬(Juglans)，屬多年生落葉果樹，具有良好的經濟價值和社會效益。新疆南疆氣候光熱資源充足，降雨量少，晝夜溫差大等獨特的氣候條件，為核桃的生長提供有利條件，核桃已成為新疆主要發展的果樹樹種之一。自2000年至今，新疆核桃產量呈現逐年增長趨勢，15 年間核桃總產量增加了 43.3 倍[1]。其中南疆地區和田、阿克蘇、喀什為核桃主產區，占新疆總產量的98.58%，截至2015 年底，南疆核桃的栽種面積已達到34.0×104hm2，掛果面積達28.24×104hm2，年總產量為58.04×104t[2]。隨著核桃種植面積的不斷擴大、大面積栽培同一品種、實際生產中缺乏栽培管理經驗等問題的出現，核桃病害也隨之增多。其中2010年在和田墨玉縣托乎拉鄉發現的核桃葉斑病是主要病害之一[3]，該病害呈現逐年加重并向外蔓延的趨勢，嚴重時發病率達100%。葉緣焦枯及大面積壞死影響核桃果實的正常生長發育，造成果實品質下降，制約了南疆果農的增收致富。【前人研究進展】韓敏等[4]明確了病原菌種類并篩選出了防治藥劑；丁俊杰等[5]調查了發病影響因子；王杰等對病害發生動態(待發表)進行了監測調查。【本研究切入點】越冬是侵染循環的一個重要且薄弱的環節，鏈格孢屬真菌在越冬期間處于休眠狀態，且潛伏場所比較固定，易于控制、消滅，掌握這個環節常常是病害防治的關鍵所在。新疆核桃鏈格孢葉斑病病原菌的越冬存活情況還未見報道。研究核桃葉斑病病原菌的越冬方式及場所。【擬解決的關鍵問題】連續兩年定期從田間采回疑似病原菌的越冬器官組織，采用組織分離法及固體平板稀釋涂布培養計數法來探明該病害病菌的越冬方式及場所，為核桃葉斑病的監測預報提供理論依據，實現對該病害的有效控制。

1 材料與方法

1.1 材 料

2016年11月～2017年2月、2017年11月～2018年2月，連續兩年在病害發生嚴重的和田市洛浦縣多魯鄉、恰爾巴格鄉、山普魯鎮、杭桂鄉、洛浦鎮五個鄉鎮的核桃園內采樣。

采用五點取樣法分別在各園隨機抽取10棵樹，每月從每棵樹下冠層東西南北四個方向采集樹上病葉及地上落葉(帶有典型病斑但無霉點)、果實、主干樹皮、一年生側枝及其芽，裝入無菌紙袋，做好標記帶回實驗室。表1

1.2 方 法

1.2.1 病原菌菌絲體在不同越冬部位分離培養

用清水沖洗干凈從每園取回的越冬組織后，放在無菌紙上晾干，從病葉的病健交界處剪取50個(0.5×0.5) cm的病組織塊，而主干樹皮、側枝、果實上未見明顯病斑，各處理隨機切取50個組織塊，每園隨機抽取50顆芽。用5%的NaClO消毒，用無菌水沖洗3次，每次1 min，在濾紙上吸干水分后移至馬鈴薯蔗糖瓊脂培養基上，每皿5塊，各處理共10個皿，做好標記后置于25℃恒溫培養，分別于3、5、8 d觀察病原菌在各越冬組織上生長的情況[6]，記錄病原菌菌落數量，根據公式(1)計算病菌的分離率，根據分離率的大小來確定病原菌菌絲體的主要越冬場所。

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表1 樣本采集數量Table 1 Sample collection

器官組織Organ tissue多魯多Duolu恰爾巴格鄉Qiaerbage山普魯鎮Shanpulu洛浦鎮Luopu杭桂鄉Hanggui樹上病葉 (片) Hanging on the tree4040404040病落葉 (片) Fallen on the ground4040404040芽 (顆) Bud5050505050一年生側枝 (根) Annual branch1010101010主干樹皮 (塊) Trunk bark5050505050果實 (個) Fruit1010101010

1.2.2 測定病菌孢子在不同生境越冬病殘體上存活率

2016、2017年在多魯鄉、恰爾巴格鄉、山普魯鎮三個鄉鎮的核桃園內分別收集密生大量病菌孢子的葉片，分裝在7個網兜中，于當年10月下旬分別掛在樹上、置于地表、埋入5、10、15、20、30 cm的土壤中，翌年2月底取回。

采用固體平板稀釋涂布培養計數法[6]。用無菌水沖洗掉病葉上的雜土、晾干，剪取帶有霉點的病斑組織，放入無菌水中制成孢子懸浮液，濃度調至低倍鏡下每個視野內的孢子數在10個左右，吸取1 mL加入到9 mL無菌水的試管中，配制成10-1的濃度，重復上述步驟，制成10-2的孢懸液。吸取0.1 mL孢懸液均勻涂布到帶有乳酸的PSA培養基表面[6]，每梯度濃度重復3次。做好標記后倒置于25℃恒溫培養，分別于3、5、8 d觀察病原菌孢子的生長情況，記錄每處理目標菌菌落數量，根據公式(2)計算不同生境下病原菌分生孢子的存活率。

(2)

1.2.3 土壤中病原菌分離

2018年2月底在多魯鄉、恰爾巴格鄉、山普魯鎮三個鄉鎮的核桃園內采用五點取樣法每園隨機抽取兩棵核桃樹，分別在樹冠下距離主干50 cm處，挖取0、2、5、10、15、20和30 cm七個土層的土樣各20 g，裝入無菌自封袋中，做好標記帶回實驗室。

采用干燥法測定土壤樣品水分[7]，采用固體平板稀釋涂布培養計數法測定不同深度土壤中病原菌數量。取5 g干燥后的土壤于三角瓶中，加入45 mL無菌水充分振蕩搖晃10 min，制成土壤懸液。濃度梯度的配制同1.2.2，每梯度濃度重復3次。做好標記后倒置于25℃恒溫培養，分別于3、5、8 d觀察記錄培養基中的菌落數量，根據公式(3)確定病原菌在不同土層深度的分離率。

(3)

2 結果與分析

2.1 病原菌菌絲體在不同越冬部位的分離結果

研究表明，每月均能從六種器官組織上分離出鏈格孢菌。從不同器官組織來看，病落葉、樹上病葉病原菌的分離率最高，均高達90%以上，其次是在側枝上的芽及主干樹皮，而一年生側枝及果實攜帶病原菌菌量最少，平均分離率為65.18%、62.58%，二者不是該病菌的主要越冬場所。圖1

從2016～2017年不同月份分離的結果來看，2016年病菌分離率由小到大為12月>2月>11月>1月，2017年病菌分離率為11月>2月>1月>12月，兩年的結果存在一定差異。從兩年對六種器官四次取樣分離的總結果來看，樹上病葉、病落葉及果實上病菌的分離率基本上呈現隨著越冬時間的延長，病原菌的總量逐漸增加的規律，而其他器官上越冬病菌數量變化趨勢不一致。

方差分析結果表明，在不同的器官組織上越冬病菌的數量之間存在一定差異，樹上病葉、病落葉、芽、主干樹皮上病菌越冬數量兩年之間均無顯著性差異(P>0.05)，果實和一年生側枝之間也如此。不同在于一年生側枝2016年的病菌數量與樹上病葉、病落葉之間有顯著差異(P<0.05)，而2017年除了與樹上病葉、病落葉之間有顯著性差異外，還與芽、主干樹皮有顯著性差異(P<0.05)。同一越冬部位不同時間的越冬病菌數量無顯著性差異(P>0.05)。由此推斷越冬病原菌存活數量的變化與月份無關，與器官組織的類型有關。圖2

2.2 病殘體上的病菌孢子在不同生境的越冬存活

研究表明，2016、2017年病殘體上的病菌孢子越冬存活數量規律基本一致。在地下5、10、15和20 cm深度越冬病殘體上的病菌孢子存活率要高于地表與樹上的，15 cm處越冬的病菌孢子存活率最高，兩年存活率分別為41.5%、35.64%。從地表到土下15 cm病菌孢子存活數量不斷增多，之后數量減少，20 cm處比15 cm分別減少了21.81%、13.04%，而30 cm土層中病菌孢子存活率明顯低于其他處理，平均存活數量僅為2.78%。

地下10與15 cm處病菌孢子存活率兩年均無顯著性差異，但15 cm與其他幾種生境都存在顯著性差異(P<0.05)。2016年樹上病葉和病落葉、土層30 cm處孢子存活率均無顯著性差異(P>0.05)，2017年結果顯示只有樹上病葉與土層30 cm處的孢子存活率無顯著差異(P>0.05)，但是病落葉上的孢子存活率要高于樹上病葉與30 cm土層。圖3

圖1 在核桃不同部位上越冬的病原菌分離率

Fig.1 The isolation rate of pathogens in different sites of walnut

圖2 兩年不同月份病菌越冬分離率

Fig.2 Overwintering separation rate of pathogens in different months of two years

圖3 不同生境病殘體上病菌孢子存活情況

Fig.3 Survival of pathogen spores in different habitats

2.3 土壤中病原菌的分離結果

研究表明，在地表土中分離到鏈格孢菌的比例最高，10-1濃度分離率為70.33%，10-2分離率為35.97%，隨著土層的加深，分離到病菌的比例逐漸降低，地表到土層2 cm處的病原菌數量下降幅度最大，平均下降了38.66%，而2 cm土層到20 cm之間病菌分離率從14.50%降到0.86%，下降幅度相對較小， 20 cm 10-1濃度病原菌分離率1.72%，10-2未分離到病原菌。

方差分析結果表明，在兩個濃度下，地表土與其他土層深度中病菌數量均存在顯著性差異(P<0.05)，在 10-1濃度下，土層2 cm處的病原菌數量和20 cm處的存在顯著差異(P<0.05)，但在10-2濃度下，土層內各深度鏈格孢菌的數量均無顯著差異(P>0.05)。圖4，圖5

圖4 不同土壤深度病原菌分離率

Fig.4 Separation rate of pathogens at different soil depths

注: A:核桃樹整體受害癥狀; B:核桃小葉受害癥狀; C:帶霉點病葉; D:同心輪紋型病斑; E:帶紫邊型病斑; F:樹上病葉的分離培養; G:芽的分離培養; H:果實的分離培養; I:一年生側枝的分離培養; J:主干樹皮的分離培養; K:落葉的分離培養; L:土層5cm病殘體的分離培養; M: 土壤15 cm 處病原菌分離培養; N:病原物的純化培養

Note: A:walnut tree overall damage symptoms; B:walnut leaf damage symptoms; C:moldy diseased leaf; D:concentric wheel-shaped lesions; E:purple-edged lesions; F:separation culture of diseased leaves on tree; G:separation culture of buds; H:separation culture of fruits; I:separation culture of annual collaterals; J:separation culture of trunk bark; K:separation and cultivation of dropped leaves; L:separation culture of plant residues buried the underground of 5cm; M:separation culture of pathogenic bacteria at 15 cm of soil; N:purification culture of pathogens

圖5 核桃葉斑病病葉癥狀及病原分離物在PSA平板上的菌落形態

Fig.5 Leaf symptoms of walnut leaf spot disease and colony morphology of pathogen isolates on PSA plates

3 討 論

病原物越冬方式有很多，營養體、各種孢子、子實體、菌核、菌索等都可以在一定條件下度過不良環境[8]，越冬場所也因病原、發病部位等不同而有所差異。此次研究結果與鏈格孢菌引起的葉部病害結果一致[9-10]，帶病落葉是許多葉部病害病原物的主要越冬場所。朱克恭[11]對銀杏葉枯病研究得出，鏈格孢菌能夠在落葉上長期存活，并占絕對優勢，王金友等[12]也認為蘋果斑點落葉病病菌在落葉上的生存比例要高于其他部位。此次研究表明芽的病菌分離率僅次于病葉，是主要越冬場所之一，這一結論與多數病害一致[12-14]。而主干樹皮四個月分離率不穩定，無明顯規律，平均分離率為79.58%，是僅次于芽的越冬場所，這一結果與棗果黑斑病相似，主干樹皮為主要的越冬場所[15-16]。

目前在相關文獻中還沒有研究對隨著越冬時間的延長，病菌的存活變化情況進行分析，但多數人的研究結果顯示，病葉上的病菌在越冬期間分離率較穩定，且基本上呈現逐漸增多的趨勢，如油松枯梢病[17]、臍橙炭疽病[18]以及川麥冬炭疽病[19]。一年生側枝的分離結果與棗果黑斑病的相似[16]，在前3個月的分離中病原菌數量逐漸減少，但最后一次分離率有所升高，但與油松枯梢病、臍橙炭疽病對枝上的病菌分離結果相反。核桃葉斑病菌在果實上的越冬變化規律與病葉上的基本一致，這一結果與棗果黑斑病在果實上越冬的情況恰好相反。

以病原菌的分離率來掌握越冬場所只能定性分析各越冬器官組織上是否存在越冬的病原菌，但是不能定量分析各器官組織上越冬病菌的數量。由于試驗中分離到的菌落有目標菌純菌落和混生菌落，對于混生菌落來說，僅統計病菌分離率不能全面反映目標菌的數量。有必要探索實驗方法來定量統計混生菌落中目標菌的數量，使研究結果更能接近實際。

水稻葉尖枯病[20]研究認為土下病殘體上病菌存活率高于土表，研究結果與其一致。萬壽菊鏈格孢葉斑病[21]、甘草葉斑病[22]的研究表明，病菌孢子在不同深度及地表的病殘體上均能越冬并成為第二年的初侵染源，而且在地下相對較深的位置越冬的病菌的存活率較高，研究結果與上述結果基本一致。而龍亞琴[23]對金剛藤葉斑病越冬病菌菌絲體的研究結果認為，埋于土下10、20 cm的病菌存活率較土上部分低，且地下相對越深的位置越冬的病菌數量越少。產生這一差異的原因可能與菌絲體和分生孢子對環境的適應性不同有關。

黃紅蘭等[18]在臍橙炭疽病中取地表土分離培養、王治江等[24]在帶有胡蘿卜斑枯病的園子中對越冬耕作層的土壤稀釋分離、張文梅等[25]在對蜜桔黑斑病的越冬場所進行調查，研究結果與上述研究基本一致，表明病原菌也能在土壤中越冬。以上研究未設置土層深度處理，僅定性的調查土壤中是否存在病原菌，而此次研究定量分析了各土壤深度中病原菌存活數量及變化規律。

確定病原菌的越冬方式及場所對病害控制有重要的指導意義，病原菌在田間存活，翌年遇到良好的環境條件就會萌發侵染植物，導致病害的流行[26]。冬春季節應及時清除樹上及地表的病殘體，及時修剪病枝，并在越冬前后為土壤打藥，或者深翻土壤，可有效降低病原菌越冬基數，減少初侵染源，控制核桃葉斑病的擴展蔓延。

4 結 論

4.1 核桃葉斑病病菌能夠以菌絲體在病株各部位越冬，主要的越冬場所是樹上殘留及落在地表的病葉，分離率高達90%，其次是芽和主干樹皮，分離率為87.67%、79.58%，而一年生側枝及果實上分離到的病原菌均不足70%。方差分析結果表明，樹上病葉、病落葉、芽及主干樹皮之間無顯著差異(P>0.05)，菌絲體數量顯著高于一年生側枝及果實，病原菌菌絲體數量的變化與越冬部位有關，與取樣分離時間無關。

4.2 病原菌能夠以分生孢子隨著病殘體在土壤內及地上部分安全越冬，在土層內病殘體上越冬的孢子數量要高于地上部分的，10～15 cm處病菌孢子存活量最高，兩年平均存活率為38.57%，之后隨著深度增加而減少，病菌在30 cm土層處僅有2.78%的存活數量。方差分析結果表明，10～15 cm的孢子數量與其余生境中的存在顯著性差異(P<0.05)。

4.3 病原菌能夠在0～20 cm土壤中越冬，但隨著土壤深度增加病原菌逐漸減少，地表越冬病菌數量最多，平均分離率為53.15%，而20 cm土層處僅分離到0.86%的病原菌，且地表土與土壤各處理中的病菌數量存在顯著性差異(P<0.05)。