非編碼RNA在膽固醇代謝中的研究進展

李傳偉 綜述 曾春雨 審校

(1.陸軍軍醫大學第三附屬醫院野戰外科研究所心內科，重慶401220；2.重慶市心血管病研究所，重慶401220)

隨著全球人口老齡化的到來，人類疾病構成發生顯著改變，動脈粥樣硬化性心血管疾病的發病率和死亡率逐年增加，動脈粥樣硬化性心血管疾病逐漸成為全球死亡的首位病因。動脈粥樣硬化性心血管疾病的病理基礎是動脈粥樣硬化，而高膽固醇血癥是動脈粥樣硬化最重要的危險因素之一。高膽固醇血癥在動脈硬化的不同階段均發揮了重要的作用，血流紊亂處內皮細胞脂質的沉積導致內皮細胞的受損，從而促進炎性細胞的黏附和浸潤。而巨噬細胞在不斷的攝取膽固醇脂質的過程中發生泡沫化并沉積在動脈粥樣硬化斑塊中使斑塊體積不斷的增大，促進了動脈粥樣硬化病變的進展，而分泌的炎性因子則促進了斑塊不穩定性增加而導致了急性冠脈綜合征的發生[1]。

血清膽固醇水平受多種因素的綜合影響，飲食習慣、遺傳變異、激素水平、運動習慣、疾病狀態、藥物干預等多種因素均可影響血脂的水平，而膽固醇的水平受一系列調控基因的共同作用，以滿足機體基本的生理需求(細胞膜組分及甾體類激素合成等)，又能避免器官過多的脂質沉積。近十幾年的研究發現，非編碼RNA在血脂水平的調控中發揮了重要的作用[2]。人類基因組計劃發現人類僅有不到2%的基因編碼了約2萬種蛋白質，而其余的98%的基因不能編碼蛋白質及多肽。非編碼RNA根據分子量的大小可以簡單分為長鏈非編碼(lnc)RNA(>200 nt)和短鏈非編碼RNA(<200 nt)[3]。短鏈非編碼RNA包括微小RNA(microRNA，miRNA)，miRNA通過與靶基因的3’非翻譯區結合形成RNA誘導降解復合體而降解目標基因的mRNA發揮轉錄后調控的作用，大量的研究已經證實miRNA在脂代謝各個階段均發揮了重要的調控作用[4]。與之形成鮮明對比的是lncRNA的研究還相對較少。lncRNA長度遠大于miRNA，其分子結構復雜性遠勝于miRNA。此外，目前已發現10萬種以上的lncRNA，數量亦遠勝于miRNA。另外，lncRNA的調控機制較miRNA更多樣，近10年的研究證實lncRNA廣泛參與機體多種生理和病理過程的調節，包括生長發育、造血過程、細胞增殖和凋亡、腫瘤發生、代謝、基因組印記、染色質修飾、病原體感染及免疫反應等過程[5-7]。非編碼RNA與其調控的蛋白編碼基因之間相互作用，形成高度復雜的RNA調控網絡，lncRNA的突變或表達異常與許多疾病的發生密切相關。

1 miRNA對膽固醇代謝的調控

miRNA廣泛參與了膽固醇的吸收、合成、轉運、分解等眾多生理過程，目前已經證實約10余種miRNA調控了膽固醇的代謝。大多數的miRNA由位于蛋白編碼基因的內含子或基因間的非編碼區域產生miRNA的前體pri-miRNA，然后于細胞質內經剪切加工成成熟的miRNA。pri-miRNA的轉錄受一系列轉錄因子的調控，而這些轉錄因子在調控miRNA轉錄的同時，亦可調控膽固醇代謝的相關基因。其中miR-33a/b位于固醇調節元件結合蛋白(sterol regulatory element-binding protein，SREBP)2和SREBP1之間。SREBP的前體以SCAP/SREBP2復合體的形式存在于細胞的內質網內，當細胞內膽固醇下降時，內質網上的SCAP/SREBP2復合體從Insig-1蛋白上解離，然后SREBP2在156位和158位賴氨酸殘基處發生修飾和水解，SCAP/SREBP2復合體在向高爾基體轉移的過程中逐漸從SCAP蛋白上解離，從而進入細胞核內轉錄一系列膽固醇合成相關基因的表達，如羥甲基戊二酰-輔酶A還原酶、低密度脂蛋白(low-density lipoprotein,LDL)受體等而促進膽固醇的合成，使LDL水平增加[8-9]。當SREBP被激活的同時，pri-miR-33亦被激活，使轉錄出的miR-33增加。miR-33進入細胞質后可以通過同膽固醇逆向轉運的關鍵分子腺苷三磷酸結合盒式轉運因子A1，和腺苷三磷酸結合盒式轉運因子A1結合，通過下調腺苷三磷酸結合盒式轉運因子A1和腺苷三磷酸結合盒式轉運因子A1抑制了膽固醇的逆向轉運，從而降低了高密度脂蛋白(high-density lipoprotein,HDL)的水平[10]。因此miRNA與鄰近的基因可以從不同的方面共同調控膽固醇代謝相關基因的表達而發揮協同效應。此外，miRNA可以同時調控多個靶基因的表達，使不同的生理及病理反應發生相應的協同改變。如miR-33在調控膽固醇代謝相關基因的同時，還可以調控脂肪酸氧化的相關基因，如肉堿棕櫚酰轉移酶1A、羥酰基輔酶A脫氫酶、Sirtuin 6、AMP激酶α亞基及胰島素代謝的相關基因，如胰島素受體底物2，因此miR-33升高后的總效應是降低HDL、升高三酰甘油(triglyceride，TG)及加重胰島素抵抗，這也可以部分的解釋為何代謝綜合征具有多種臨床表現(中心性肥胖、高TG、高血壓、高血糖及低HDL-C)，同時也解釋了代謝綜合征患者動脈粥樣硬化風險的原因，因為這些臨床表型是在共同的“土壤”中產生，而miRNA在其中扮演了“分子紐帶”的作用。

由于mRNA與miRNA通過7個mer的堿基互補配對結合，因此基因3’非翻譯區上可以結合多個miRNA，同一個膽固醇代謝相關的基因還可以受多個miRNA共同調控，如上述的腺苷三磷酸結合盒式轉運因子A1除受miR-33調控外，還同時受miR-148a、miR-758、miR-128-1、miR-130b、miR-27a/b、miR-10b、miR-144、miR-302a、miR-26及miR-301b等miRNAs調控[11-14]。這些miRNA與mRNA及相應的轉錄因子、信號傳導分子間相互作用，共同形成一個復雜的調控網絡，以維持機體內膽固醇的平衡。

2 脂蛋白內miRNA 的作用

miRNA除在細胞內調控膽固醇的代謝外，近十年的研究還發現外周血液循環中同樣存在多種miRNA。循環miRNA通過與膜泡結構(微泡、外泌體、囊泡)或蛋白載體(Ago2、NPM1)結合穩定存在，避免被血液中廣泛存在的RNA酶所降解。循環miRNA可以進入特定細胞胞漿內，并影響其靶基因mRNA的翻譯效率，從而調控細胞功能。循環miRNA種類和含量的變化反應了疾病的狀態，同時亦參與了疾病的進展。2011年，Vickers等[15]在《Nat Cell Biology》發表文章證實HDL是一種新的循環miRNA的蛋白載體，HDL內含有多種miRNA，此外LDL、極低密度脂蛋白(VLDL)內亦含有一定數量的miRNA，且種類及數量均有別于HDL。HDL通過攜帶miRNA參與了巨噬細胞與肝細胞間的通訊，此外HDL中所含miRNA的頻譜與疾病狀態是明顯相關的，在家族性高膽固醇血癥及肥胖患者中，miR-223的含量顯著上升[15]。肝細胞通過清道夫受體-B1受體攝取HDL的同時，可以將HDL中攜帶的miR-223也一同轉運進入肝細胞胞漿內，并影響了靶基因RhoB mRNA的翻譯效率，從而調控肝細胞的相關功能，此外，HDL還可以將其中的miR-223轉移至內皮細胞，從而抑制細胞間黏附因子1的表達，影響內皮細胞炎癥因子的釋放而發揮抗炎的效應[16]。與此同時，miR-223進入肝臟細胞后，還可以通過抑制清道夫受體-B1的表達而調控肝臟對HDL的攝取，同時還可通過抑制3-羥-3-甲基戊二酰輔酶A合成酶1的活性而抑制肝臟膽固醇的合成[17]。脂蛋白能攜帶miRNA與其特殊的結構相關，LDL主要由載脂蛋白apoB100、膽固醇等構成，而HDL則由載脂蛋白apoAI、膽固醇及TG等構成。兩者均為球形大分子，分子結構非常相似。脂蛋白中分子極性排列，形成外層親水，內層親脂的雙層結構，類似于脂質體，因此可以作為內源性核酸類物質的天然載體[18]。因此，脂蛋白除本身作為膽固醇的載體外，還可以通過內部的miRNA參與了多種生理過程的調節，這也部分解釋了HDL除具有膽固醇逆向轉運的功能外，還能發揮抗炎癥、抗氧化、抑制血小板活化、保護內皮功能等作用。

3 lncRNA對膽固醇代謝的調控

與miRNA相比，雖然lncRNA數量眾多，目前lncRNA調控膽固醇代謝的研究還相對較少，而已經揭示其調控分子機制的lncRNA數量更是鳳毛麟角，這與lncRNA的本身分子結構和人們以往的研究不足相關。首先，與mRNA和miRNA不同，lncRNA的表達和分布呈高度的種屬、組織、細胞和發育階段的特異性，人類的lncRNA中僅有不到20%的lncRNA可以在常見的模式動物上尋找到同源序列，使得其在動物上的過表達或敲除的功能研究陷入了困境。而其組織特異性的表達，大部分的lncRNA主要在睪丸組織中呈高表達，而在常見的易取材的組織中卻呈低表達，使得其在體研究較難開展。而其發育階段的特異性使得有的lncRNA僅在胚胎發育的特定階段發揮作用，如lncRNA XIST介導的X染色體失活，若在常見的腫瘤細胞系中很難復制到同樣的過程[19]。其次，lncRNA的分子量要遠高于miRNA，其三維分子結構不能簡單的通過堿基的組成而得到推算。而lncRNA作用的靶基因亦不能簡單的通過堿基互補而預測，同一個lncRNA，其5’端和3’端可結合不同的蛋白和基因，發揮不同的調控作用。最后，lncRNA本身的調控機制復雜，已經被證實的機制包括：轉錄抑制、染色質重構和組蛋白修飾、RNA剪切、內源性siRNA、分子伴侶、小分子RNA(如miRNA、piRNA)的前體分子、miRNA的分子“海綿”等多種機制在細胞核內或細胞質中，順式或反式調控靶基因的表達[20-21]。

既往的一些研究顯示lncRNA在血脂調節中發揮重要的作用，如：小鼠肝臟特異性表達的lnc-LSTR可以同TDP-43形成蛋白復合體來調控膽酸合成通路關鍵基因Cyp8b1的表達，并進而通過FXR核受體而影響載脂蛋白apoC2的表達從而調控肝臟TG的代謝[22]。而APOA1基因反義鏈上的lncRNA APOA1-AS則可以通過與組蛋白修飾蛋白復合體中的LSD1及EZH2蛋白亞基結合改變染色體組蛋白甲基化而調控正義鏈上APOA1的表達[23]。大鼠肝臟內lnc-HC可以與hnRNPA2b1結合從而調控下游腺苷三磷酸結合盒式轉運因子A1及CYP7A1的表達而負向調節膽固醇的水平[24]。lncRNA LeXis 可以與轉錄輔助因子RALY結合，從而抑制膽固醇合成關鍵基因SREBP2、HMGCS、FDFT1、CYP51等基因的表達，從而降低肝臟膽固醇合成及血清膽固醇水平。同時lncRNA LeXis的轉錄受膽固醇代謝關鍵轉錄因子肝臟X受體的調控，從而形成復雜的調控網絡[25]。在巨噬細胞泡沫化過程中，氧化LDL誘導lincRNA-DYNLRB2-2表達增加，并通過GPR119而升高腺苷三磷酸結合盒式轉運因子A1的表達而促進膽固醇的逆向轉運和抑制炎癥反應[26]。而同樣在巨噬細胞泡沫化過程中，RP5-833A20.1通過升高miR-382-5p的表達而抑制核因子 IA表達，從而調控了細胞內膽固醇的逆向轉運及炎癥因子的表達[27]。

4 非編碼RNA作為調脂治療靶點的轉化研究

目前對于冠心病等動脈粥樣硬化的高危人群，國內外調脂治療指南均推薦高強度的他汀類藥物或強化他汀類藥物治療以進一步降低心血管事件的殘余風險，但是他汀類藥物劑量翻倍的同時，其降低LDL-C的幅度僅增加6%，即他汀類藥物的“6%的原則”。此外，高強度的他汀類藥物治療帶來肝臟損害、橫紋肌溶解等并發癥的發生率成倍增加。因此，聯合其他類型的調脂藥物治療方案成為進一步降低膽固醇水平的新的治療方向。鑒于非編碼RNA在脂代謝中的重要調控作用，針對miRNA、lncRNA的轉化研究亦已開始進入臨床前研究。

由于常用的嚙齒類動物缺乏膽固醇酯轉移蛋白表達等原因，大小鼠血脂譜表現為高HDL和低LDL，與人類血脂譜相反，故嚙齒類動物常規高脂喂養較難誘導出動脈粥樣硬化斑塊。因此，針對miRNA干預的臨床前研究最佳的模型應為非人靈長類。Rayner等[28]發現給予非洲綠猴針對miR-33a和miR-33b的寡核苷酸后，全身miR-33a和miR-33b的表達明顯降低，與此同時，肝臟腺苷三磷酸結合盒式轉運因子A1表達升高，HDL-C水平明顯升高并持續12周以上，HDL介導的膽固醇逆向轉運亦增加，說明抑制miR-33不僅增加了HDL-C的量，還增強了HDL的功能。同時，給予寡核苷酸后，肝酶、肌酶、膽紅素、肌酐等并沒有明顯的改變，說明寡核苷酸介導的miRNA干擾短期是安全的。目前尚無專門的針對高脂血癥的miRNA臨床研究，但已有miRNA干擾或過表達治療慢性丙型病毒性肝炎等疾病臨床研究正在進行。RG-101是N-乙酰半乳糖胺結合的抑制miR-122表達的寡核苷酸，在Ⅰ期臨床試驗中(EudraCT臨床試驗注冊號2013-002978-49)，在一次給予2 mg/kg或4 mg/kg的RG-101治療4周后，血清中丙肝病毒量分別下降4.42 log10IU/mL 及5.07 log10IU/mL,甚至有部分治療組病例在76周后血清中病毒量低于了檢測范圍。由于miR-122在肝臟膽固醇的代謝中發揮了重要的調控作用，在RG-101組可觀察到總膽固醇有0.9～1.4 mmol/L的降低，此外LDL-C、TG及HDL-C均有不同程度的下降，因此以miR-122作為靶點亦可發揮調脂的治療效應[29]。Miravirsen是鎖核酸硫代磷酸DNA修飾的miR-122的反義核苷酸，在miravirsen的Ⅱa期臨床試驗中，miravirsen亦表現出強大的抑制丙型肝炎病毒復制的能力，因此miravirsen將有可能成為第一個被美國食品藥品監督局批準上市的miRNA類的藥物[30]。

除抑制miRNA的表達外，還可以通過過表達miRNA發揮調脂效應，但與抑制miRNA相比，過表達miRNA需要克服的巨大的技術難題在于如何完整的將miRNA的mimic轉移到靶細胞的細胞膜內而不被RNA酶所降解。在系統性給予的過程中，需要借助質粒、腺病毒、腺相關病毒、慢病毒、脂質體、納米顆粒等載體進行轉染。Mirna Therapeutics公司開發的miR-Rx34是第一個進入Ⅰ期臨床試驗的以脂質體為載體過表達miRNA以針對原發性肝癌及其他實體腫瘤的藥物，在給予miR-Rx34后，盡管腫瘤組織內miR-34a水平明顯升高，但有5例志愿者在研究過程中發生了嚴重的免疫相關不良反應，因而于2016年9月終止進一步試驗。此外，生物載體(腺病毒、腺相關病毒、慢病毒)由于其安全性及倫理問題，目前也僅限于實驗室研究，要進入人體試驗尚有許多問題需要解決。而HDL作為內源性的miRNA的載體，與上述的載體相比有許多的優勢。首先，HDL作為人體本身存在并大量表達的天然蛋白，可由患者自身提取并回輸入體內，其生物安全性要明顯高于生物載體。其次，HDL代謝的相關途徑及受體已研究得非常透徹，HDL可以通過受體被肝臟所攝取，其次其最理想的靶器官主要為肝臟。最后，HDL在體內的代謝時間為數天，較其他載體相比其體內存留時間較短，不必擔心病毒長期感染的問題。盡管如此，以HDL作為載體還有一些關鍵問題需要解決。首先，天然的HDL攜帶的miRNA量有限，一旦被消耗需持續的補充。其次，同一個miRNA可干擾不同的基因，其功能多樣性很難達到分子特異性干預的目的。另外，不同脂蛋白之間存在脂質的交換，其所攜帶的miRNA是否也發生了交換，目前尚不清楚。 最后，HDL攜帶miRNA后亦有可能改變分子結構，導致免疫反應和炎癥的激活。目前由于lncRNA調控脂代謝的研究還處于起步階段，更多的還集中在基礎研究，很多lncRNA的機制還不清楚，因此針對lncRNA的臨床研究尚未開展。

5 結論及展望

以miRNA及lncRNA為代表的非編碼RNA是脂代謝重要的調控分子，非編碼RNA在膽固醇的消化、吸收、合成、轉運及分解等各個階段均發揮了重要的作用。不斷的基礎及臨床研究不但能夠揭示非編碼RNA在脂代謝中的分子機制，而且有望發現新一代降脂藥物的作用靶點。如何加快基礎研究結果的轉化，成為造福眾多患者的利器，將是今后基礎研究者及臨床工作者的重點關注方向。