外泌體生物學特性及其miRNAs治療心肌梗死的研究進展

彭子健 綜述 陳建英 審校

(1.廣東醫科大學，廣東湛江524023；2.廣東醫科大學附屬醫院心內科，廣東湛江524001)

心肌梗死作為冠心病的典型代表嚴重危害人類健康。中國居民2002—2015年心肌梗死死亡率總體呈上升趨勢，而在美國，每年超過36萬人死于冠心病，其中12萬人死于心肌梗死[1]。如何提高梗死區域心肌細胞存活率、促進血管新生、減輕心肌纖維化及炎癥反應、改善梗死后心功能等是心肌梗死研究領域關注的重點。近年來，干細胞移植治療心肌梗死初見成效[2]，但其分化為成熟心肌細胞的概率很低，且移植后3周內存活率低至1%，然而干細胞發揮的心臟保護作用卻至少維持了6個月[3]，提示其保護效應并非依賴于分化作用[4]。隨后的研究證實，干細胞主要通過旁分泌機制釋放外泌體從而發揮相應的生物效應，此外，大量證據表明干細胞源性外泌體的心臟保護作用與其攜帶的miRNAs密切相關?，F對外泌體生物學特性及干細胞源性外泌體miRNAs在心肌梗死治療中的研究進展做一綜述。

1 外泌體生物學特性

外泌體(exosomes)是細胞分泌的直徑為30～150 nm，密度為1.11～1.19 g/mL的脂質雙分子層膜囊泡，其內含有大量蛋白質、核酸、脂質等生物活性物質[5]。據外泌體數據庫ExoCarta(http://www.exocarta.org/)統計，目前不同來源的外泌體內已檢測出9 769種蛋白，2 838種miRNA及1 116種脂質。外泌體作為生物活性物質的運輸載體，在介導細胞間信號傳遞過程中發揮著重要作用，此外，外泌體因其低免疫原性、易于獲取改造等優勢，已被廣泛用于心血管疾病的診治研究工作中[6]。

1.1 外泌體的形成、釋放與攝取

不同細胞來源或細胞處于不同微環境中所分泌的、通過不同途徑進入體內的外泌體，其組成成分、分布歸巢及發揮的生物學效應均不盡相同[7]。外泌體的這一異質性緣于其復雜的分泌及作用機制。細胞膜以內出芽(inward budding)的方式形成早期核內體(early endosome)，隨后早期核內體界膜(limiting manbrane)內陷，形成多個腔內囊泡(intraluminal vesicles,ILVs)，此時包含ILVs的早期核內體稱作多泡核內體(multivesicular endosomes,MVEs)[8]。大部分的MVEs將與溶酶體、自噬體相融合并最終被降解，而小部分的MVEs將在Rab蛋白家族等協助下運送至細胞膜并與之融合，最終將ILVs釋放出胞外，而被釋放至細胞外環境的ILVs即為外泌體[9]。隨后靶細胞將會通過膜表面配體-受體結合、胞吞作用或胞膜融合等方式攝取外泌體[10]。大部分進入靶細胞內的外泌體將被溶酶體所降解以供細胞代謝所需，僅有小部分的外泌體得以釋放出內容物，并以此介導細胞間信號交換[9]。目前關于多泡核內體及外泌體在胞內不同命運的調控機制尚未闡明，但已有研究發現，運輸所需核內體分選復合物依賴及非依賴性途徑在調控這一復雜生物過程中起著重要作用，其中研究較為透徹的相關蛋白包括：4次跨膜轉運蛋白家族(tetraspanin,CD9、CD63、CD81)、ALG-2相互作用蛋白X、腫瘤易感基因101蛋白及熱休克蛋白70等[11]。

1.2 外泌體的提取、鑒定及儲存

當前廣泛用于提取外泌體的方法有：超速離心、超濾、聚乙二醇沉淀、密度梯度離心、免疫親和捕獲等，因其提取效果各異，故推薦采用優勢互補的復合型提取方法以避免脂蛋白、病毒等雜質污染[12]。目前認為，外泌體的鑒定需通過電子透射電鏡，納米粒子跟蹤分析及蛋白免疫印記等實驗的相互印證[13]，此外，新近研發的納米級側向位移微流控芯片[14]與超高靈敏流式細胞儀[15]均被報道可用于鑒定外泌體，其效果有待進一步驗證。日常實踐中，常將外泌體短期保存于4℃或長期儲存于-80℃的環境里，而研究表明，外泌體在不同凍存條件下均會發生諸如內容物丟失、形態結構變異等生物特性的改變[16]，為此建議選用新鮮提取的外泌體進行研究以提高實驗的準確性及可靠性。

2 干細胞源性外泌體miRNAs與心肌梗死

干細胞具備強大的體外擴增及旁分泌效應，是獲取外泌體的種子細胞。研究表明，外泌體內成熟miRNAs占總RNA含量的41.7%，是介導細胞間信號交換的關鍵成分[17]。MiRNA即微小RNA(microRNA)，是一組高度保守的小分子單鏈非編碼RNA，由18～24個核糖核苷酸組成，主要通過抑制靶基因轉錄后翻譯從而調節機體重要生命活動。越來越多的證據表明miRNAs參與調控心肌細胞的存活、增殖及血管新生等一系列心血管重要生理過程[18]，為此對近年來干細胞源性外泌體miRNAs治療心肌梗死的研究進展作一梳理，以供參閱。

2.1 骨髓間充質干細胞源性外泌體miRNAs

骨髓間充質干細胞(BMMSC)因其來源廣泛，易于獲取，是制備外泌體的理想母體細胞。Zhang等[19]通過miRNA基因芯片分析發現，大鼠BMMSC來源的外泌體可通過上調miR-147等17個miRNAs，下調miR-326-5p等5個miRNAs從而調控血管內皮生長因子(VEGF)、磷酸肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)、Wnt等相關通路，促進大鼠c-kit+心肌干細胞增殖遷移及血管新生。Shao等[20]則通過miRNA基因測序發現，大鼠BMMSC來源的外泌體通過上調miR-29、miR-24等，下調miR-130、miR-34等，進而調控Ras、PI3K/Akt、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白等通路，促進H2O2氧化應激損傷下大鼠胚胎心肌細胞(H9c2)的存活，減少心肌梗死區域纖維化及炎癥浸潤。此外，Yu等[21]發現，過表達心肌轉錄因子的大鼠BMMSC，其分泌的外泌體富含miR-19a，可通過抑制下游靶基因PTEN及Bcl-2相互介導因子的表達從而激活Akt/ERK通路，提高大鼠心肌細胞存活率，改善心肌梗死后心臟收縮功能。Chen等[22]則發現過表達miR-133a的大鼠BMMSC，其分泌的外泌體富含miR-133a，可通過抑制下游靶基因Snail-1(鋅指蛋白的一種)的表達從而促進缺氧損傷下BMMSC的存活，減少心肌纖維化。除大鼠來源的BMMSC外，人體來源的BMMSC亦備受關注。Ferguson等[23]通過miRNA基因芯片分析發現，人BMMSC來源的外泌體高表達miR-1246等23個miRNAs，其中miR-199a可通過作用于靶基因CABLES1進而抑制Bax、P53及天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶9(caspase 9)的表達，減少H2O2刺激下小鼠心肌細胞的凋亡，而miR-130a-3p則可通過抑制HOXA5的表達，增強人臍靜脈內皮細胞的成管能力。另外，Mayourian等[24]發現人BMMSC來源的外泌體可通過miR-21-5p作用于PI3K通路從而調控鈣表達，增強心肌細胞收縮力。

2.2 心臟祖細胞及心球樣細胞源性外泌體miRNAs

心臟祖細胞(CPC)及心球樣細胞(CDC)因其能夠客觀地反映出心臟梗死區域發生的變化而備受關注。Gray等[25]通過微陣列分析發現，大鼠CPC經缺氧預處理后所分泌的外泌體高表達11個miRNAs，其中miR-292等7個miRNAs的差異性表達在隨后的熒光定量聚合酶鏈式反應實驗中得到驗證。進一步研究發現，CPC來源的外泌體可通過miR-17及miR-210等作用于纖維化相關基因從而降低結締組織生長因子及波形蛋白的表達，改善心肌纖維化。Xiao等[26]發現，大鼠CPC經H2O2預處理后所分泌的外泌體富含miR-21，隨后通過雙螢光素酶報告基因證實miR-21可與程序性細胞死亡蛋白4結合從而抑制其表達，減少氧化應激損傷下H9c2心肌細胞的凋亡。與大鼠來源的干細胞相比，人體來源的干細胞更有望用于臨床轉化。Tseliou等[27]研究發現，人CDC來源的外泌體可通過傳遞miR-146a-5p等作用于人心肌纖維母細胞，抑制其分泌轉化生長因子-β，促進其分泌基質細胞衍生因子及VEGF從而減輕大鼠心肌纖維化，改善心室重構及心功能。另外，Geoffrey等[28]通過RNA-基因測序分析發現，人CDC來源的外泌體富含miR-181b，可通過抑制蛋白激酶C δ的表達從而調控巨噬細胞極化，減少實驗動物(大鼠、豬)梗死區域內CD68+巨噬細胞的浸潤，發揮心臟保護作用。此外，Namazi等[29]發現，人CDC經缺氧預處理后所分泌的外泌體富含miR-210及miR-130a等具有促血管生成效應的miRNAs，可能通過抑制肝配蛋白A3及HoxA5的表達，增強人臍靜脈內皮細胞成管能力從而促進新生血管形成。

2.3 誘導多能干細胞與胚胎干細胞源性外泌體miRNAs

目前關于誘導多能干細胞(iPS)與胚胎干細胞(ESC)的研究相對較少，可能與其潛在的致瘤、致畸性等安全隱患相關。Adamiak等[30]將iPS來源的外泌體與小鼠心肌內皮細胞共培養后發現，心肌內皮細胞遷移、存活及血管新生能力增強。在隨后的體內實驗中證實，通過心肌內注射的方式將外泌體注入小鼠心肌梗死區域后可有效改善其左心室重構及心功能，且效果優于iPS。進一步研究發現，與iPS比較，外泌體內特異性表達miR-145等33個miRNAs，可能通過調控Wnt、PI3K/Akt、絲裂原激活蛋白激酶、VEGF等通路從而發揮相應的心臟保護作用。Khan等[31]通過miRNA基因芯片分析發現，小鼠ESC來源的外泌體特異性表達59個miRNAs，其中miR-294可通過調控細胞周期進程從而提高H2O2氧化應激損傷下小鼠心臟祖細胞的存活率及增殖能力。

3 展望

目前關于干細胞源性外泌體通過miRNAs治療心肌梗死的研究層出不窮，但大多只關注于miRNAs及其下游機制的探索，而致力于miRNAs上游調控的研究則相對較少。最近有關長鏈非編碼RNA、環狀RNA與miRNAs之間相互作用的研究已逐步開展，有望進一步闡明非編碼RNA在心血管領域的作用機制。當前，外泌體的研究仍處于起步階段，如何提高外泌體的分離純度、準確地對其亞型進行分類[32]以及如何改善外泌體靶向性[33]等將是今后外泌體研究領域的重點。相信通過研究人員的不懈努力，外泌體可作為干細胞治療的替代療法早日應用于臨床。