免疫檢查點抑制劑療效預測標記物

游路寬，胡 毅

解放軍總醫院 腫瘤內科，北京 100853

免疫檢查點抑制劑(immune checkpoint blockades，ICBs)是免疫療法中最前沿的技術之一，其對免疫應答的調控不受腫瘤組織學或腫瘤特異性抗原的影響。目前，應用最廣泛的ICBs當屬靶向細胞毒性T淋巴相關抗原4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4)、細胞程序死亡蛋白1(programmed death-1，PD-1)和細胞程序死亡蛋白-配體1(programmed cell death protein ligand 1，PD-L1)的單克隆抗體[1-2]，如納武單抗、帕姆單抗、伊匹單抗和阿特珠單抗等。因此，深入研究腫瘤的免疫逃逸機制并找出關鍵靶點，準確有效地區分出能從治療中獲益的患者，為其制訂有效的治療方案，能夠實現更為精準的個體化免疫治療。本綜述對目前臨床正在使用或有極大應用潛能的ICBs療效預測生物標記物進行概述。

1 細胞程序死亡蛋白-配體1

腫瘤組織的PD-L1表達狀態評估是目前臨床使用ICBs的主要依據之一。這一發現源于一項評估納武單抗在非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)、黑色素瘤、前列腺癌、腎癌和結直腸癌中安全性的Ⅰ期臨床試驗[3]。42例患者腫瘤組織的PD-L1表達大于5%定義為表達陽性，發現17例PD-L1表達陰性患者對納武單抗無應答，而25例PD-L1表達陽性的患者中9例出現客觀應答(objective response，OR)。2016年11月10日《新英格蘭》雜志刊登了默沙東公司一項名為KEYNOTE-024的Ⅲ期臨床試驗最新進展：帕姆單抗用于PD-L1表達大于50%的NSCLC患者的一線治療，無進展生存時間(progress free surviva，PFS)和客觀應答率(objective response rate，ORR)分別為10.3個月和44.8%，顯著高于化療組的6.0個月和27.8%[4]。然而在2017年6月22日《新英格蘭》雜志上，百時美施貴寶公司發表名為CheckMate-026Ⅲ期臨床試驗結果：在PD-L1表達＞5%的晚期初治或復發性NSCLC患者的一線治療中，納武單抗相對于以鉑類為基礎的化療并未帶來更長的PFS(4.2個月vs 5.9個月)和OS(14.4個月vs 13.2個月)[5]。

PD-L1作為腫瘤生物標記物不能正確區分ICBs治療獲益的患者，受多方面因素的影響。首先，除了γ干擾素(IFN-γ)外，其他細胞因子(如STAT3和NF-κB)和癌基因信號(如MAPK或PI3K/Akt通路)均可誘導PD-L1表達，因此PD-L1分子的表達與抗腫瘤免疫應答不一定存在對應關系[6]。其次，除了腫瘤細胞，腫瘤微環境中浸潤的免疫細胞亦可表達PD-L1，且PD-L1的表達存在時空異質性，因此某一時間點單個腫瘤部位PD-L1檢測不能準確反映患者腫瘤組織PD-L1的真實表達情況[7-8]。此外，不同的試驗使用不同公司的PD-L1免疫組化抗體，且沒有設定統一的陽性截斷值，導致臨床上無法以統一的標準對患者進行選擇[5,9]。最后，腫瘤細胞可以同時表達其他多種免疫檢查點，如T細胞免疫球蛋白結構域和黏蛋白結構域-3、淋巴細胞活化基因-3分子和CTLA-4等，以逃避免疫系統的監測[10]。因此，單獨使用PD-L1作為預測ICBs療效的生物標記物可能會導致患者選擇的偏倚，腫瘤細胞PD-L1表達聯合其他標記分子如腫瘤浸潤淋巴細胞(tumor infiltrating lymphocytes，TILs)能更準確地反映腫瘤的免疫原性。

2 錯配修復蛋白缺陷和微衛星不穩定

微衛星是基因組上長度為1 ～ 6 bp的短串聯重復序列。在DNA復制時該區域堿基容易發生突變，正常情況下錯配修復蛋白(mismatch repair protein，MMR)可修復突變的堿基，若體內錯配修復蛋白缺陷(mismatch repair protein deficiency，dMMR)容易導致微衛星不穩定(microsatellite instability，MSI)的發生。腫瘤細胞發生MSI，腫瘤組織的突變負荷亦隨之增加，最終使新抗原產生的機會增多，產生的新抗原刺激特異性T淋巴細胞增殖并對腫瘤組織進行浸潤。研究表明攜帶MSI的癌癥患者對ICBs治療應答率增高[11]。Le等[12]開展了一項Ⅱ期臨床試驗，旨在評估帕姆單抗對化療無效的晚期結直腸癌及非結直腸部位的其他腸癌患者的臨床療效，結果表明伴有MSI/dMMR的結直腸癌患者免疫相關的ORR和無進展生存率分別為40%和78%，而無MSI/dMMR結直腸癌患者免疫相關的ORR和無進展生存率分別為0和11%。此外，MSI/dMMR的非結直腸部位其他腸癌患者免疫相關的ORR和無進展生存率也高達71%和67%，提示dMMR或MSI可作為ICBs的療效標記物。在另一項臨床試驗(NCT01876511)中，包括NSCLC、結直腸癌和黑色素瘤等12種實體瘤在內的86例攜帶MSI-H/dMMR的晚期腫瘤患者接受帕姆單抗治療后，53%的患者(46例)實現客觀緩解，21%的患者(18例)達到完全緩解，77%的患者(66例)病情得到控制，包括病情穩定、部分緩解和完全緩解[13]。2017年5月24日，美國食品和藥物管理局批準PD-1抗體帕姆單抗用于治療攜帶有高度微衛星不穩定(MSI-H)或錯配修復蛋白缺陷的多種實體瘤，成為首個不根據腫瘤組織類型，而根據腫瘤生物標記物進行區分的腫瘤免疫療法。這一顛覆性舉措表明MSI/dMMR作為腫瘤生物標記物對ICBs治療療效有預測能力。

3 突變負荷及新抗原負荷

腫瘤突變負荷(tumor mutational burden，TMB)是指在一份腫瘤組織樣品中，所評估基因的外顯子編碼區發生堿基置換、插入或缺失突變的總數。TMB越高，多肽段、蛋白片段或新生抗原等產生的概率越高。這些新的蛋白被自身免疫系統識別為外來抗原，激活T細胞，引起機體免疫系統的抗腫瘤反應[14]。目前，在很多研究中都證實TMB和腫瘤新抗原負荷與ICBs的療效相關[14-16]。Snyder等[17]采用全外顯子測序方法對接受伊匹單抗治療的64例晚期黑色素瘤患者腫瘤組織進行分析，發現TMB與患者臨床獲益呈正相關，病情獲得持續緩解的患者其腫瘤組織的非同義突變總數超過100個。此外，Van Allen等[18]對接受伊匹單抗治療的110例黑色素瘤患者的腫瘤組織進行分析發現，突變負荷和新抗原負荷與該藥的臨床獲益呈正相關。在2017年美國癌癥研究協會年會(AACR2017)上，一份對CheckMate026試驗的回顧性分析報告表明，高TMB負荷的NSCLC患者接受納武單抗治療后，ORR和PFS分別為47%和9.7個月，顯著高于化療的28%和5.8個月[5]。可見，以TMB作為納武單抗治療NSCLC的生物標記物，能更好地區分可能從治療中獲益患者。這些研究結果均表明，突變負荷和新抗原負荷有作為ICBs療效預測標記物的巨大潛能。

雖然TMB作為ICBs療效預測生物標記物具有良好的應用前景，但仍存在不小的挑戰。比如，目前針對TMB的臨床研究均采用不同的檢測平臺，對高TMB的定義也沒有統一的標準。此外，不同腫瘤的突變負荷也有顯著差異，設定不同的截斷值也顯得十分必要[19]。

4 免疫基因標簽

越來越多的研究表明，在轉錄水平對腫瘤組織特征進行全面系統的評估，能更好地反映腫瘤微環境中固有免疫和適應性免疫應答，進而更準確地預測腫瘤患者對ICBs治療的應答情況。Seremet等[20]使用轉錄組測序技術對12例接受伊匹單抗或伊匹單抗聯合樹突狀細胞治療的轉移性黑色素瘤患者的腫瘤組織進行分析，發現64個與伊匹單抗治療應答密切相關的基因。這些基因包括FYB、CXCL9、CD69、CD8A、CARD11、CD5、IGHA1、IGHG3、IGHV3-23和IGHGP等，主要參與機體固有免疫和適應性免疫。通過卡普蘭-邁耶生存曲線分析發現這些免疫相關基因與患者的預后顯著相關，免疫相關基因高表達患者的OS和PFS分別為44個月和26個月，顯著高于免疫相關基因低表達患者的9個月和4個月。此外，Ribas和Lo等對28例接受ICBs治療的黑色素瘤患者進行研究也得出相似的結果[21]。對治療應答和治療抵抗患者的差異表達基因進行富集分析發現，治療抵抗患者治療前腫瘤組織中免疫抑制基因顯著高表達。更有趣的是，使用基因集合變異分析(gene set variation analysis，GSVA)方法，筆者發現26個與ICBs治療抵抗密切相關的特征基因，這些特征基因不僅參與細胞的上皮間質轉化及血管生成，與機體抗腫瘤免疫應答亦顯著相關。

5 腫瘤浸潤免疫細胞

腫瘤浸潤性淋巴細胞(tumor infiltrating lymphocytes，TILs)是機體抗腫瘤免疫的效應細胞，也是ICBs作用的靶細胞。不少研究表明，在多種實體瘤中，腫瘤組織內TILs的浸潤程度和類型顯著影響腫瘤患者的預后[22-24]。一項評估TILs亞群與卵巢癌患者PFS和OS關系的Meta分析表明，腫瘤內CD3(+) TILs和CD8(+) TILs的浸潤可以顯著提高患者的PFS，而CD3(+) TILs、CD8(+) TILs和CD103(+) TILs則與患者的OS呈正相關[25]。KEYNOTE-001試驗分析晚期黑色素瘤患者腫瘤組織中TILs與帕姆單抗治療應答的關系，發現響應帕姆單抗治療的患者治療前腫瘤邊緣和間質內的CD8(+) T淋巴細胞的浸潤密度顯著高于腫瘤進展的患者[26]。隨著研究的深入，人們逐漸意識到如果淋巴細胞被血管、細胞外基質和細胞因子等限制在腫瘤基質內而無法浸入腫瘤實質并與腫瘤細胞接觸，即使ICBs能解除這些TILs的抑制狀態，它們仍無法執行腫瘤的免疫清除功能[27]。因此，TILs作為ICBs療效預測標記物，不僅要考慮其浸潤密度和類型，TILs的空間分布也尤其重要。

除了T淋巴細胞，腫瘤微環境內浸潤數量最多的免疫細胞為腫瘤相關巨噬細胞(tumor associated macrophages，TAM)[28]。TAM不僅通過提高基因組不穩定性、培育腫瘤干細胞和馴化適應性免疫等機制促進腫瘤進展，還可以通過持續促進腫瘤血管生成和組織修復反應以抵抗各種方式的腫瘤治療[29]。近來，Arlauckas和Garris[30]利用活體顯微成像技術實時觀察ICBs在小鼠癌癥模型中的動態變化，發現結合到CD8(+) T細胞表面的ICBs在短時間內即可被TAM吞噬而失去抗腫瘤作用。進一步分析發現TAM是通過其表面的Fcγ受體介導對ICBs的特異性吞噬，若在接受ICBs治療之前先經過Fc受體抑制劑處理，可使得小鼠模型中腫瘤完全消失。這些發現表明，TAM不僅是有效的腫瘤免疫治療靶細胞，也是潛在的ICBs臨床療效預測因子。

6 外周血標記物

機體整體免疫狀態不僅影響腫瘤發生發展進程，甚至影響腫瘤患者的免疫治療效果。在本文前面內容提及的PD-L1、錯配修復蛋白缺失和微衛星不穩定、突變負荷和新抗原負荷、免疫基因標簽及腫瘤浸潤淋巴結細胞主要是針對腫瘤組織在基因、蛋白和細胞不同水平進行檢測并預測ICBs的療效。而作為機體免疫系統的不可或缺的部分，腫瘤患者外周血免疫狀態亦可作為接受ICBs治療的一個便捷、無創的生物學標記物。對接受伊匹單抗治療的晚期黑色素瘤患者外周血細胞進行研究發現，外周血基線水平的淋巴細胞比例大于10.5%、FoxP3(+)調節性T細胞(regulatory T cells，Treg)比例大于1.5%、CD8(+)Ⅰ型效應記憶細胞(effector-memory type 1，EM1)的比例大于13%，且中性粒細胞絕對計數小于7 500/μl、中性粒細胞/淋巴細胞比例小于3，骨髓源性抑制細胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)比例小于5.1%、CD8(+)分化晚期效應記憶細胞的比例小于23.8%時，伊匹單抗治療可以顯著延長患者的PFS和OS[31-33]。這些標記物除在基線水平具有療效預測作用，在治療過程中的動態變化也可以反映患者的治療應答情況，如對伊匹單抗治療應答的黑色素瘤患者外周血FoxP3(+)Treg隨治療療程增加而持續降低[34]。在對PD-1/PD-L1抗體的研究也得出相似的結果，分析616例接受帕姆單抗治療的晚期黑色素瘤患者的外周血發現，基線水平嗜酸性粒細胞比例大于1.5%或淋巴細胞的比例大于17.5%可以顯著延長患者的OS[35]。在一項納入29例NSCLC患者的試驗中，研究者發現在接受抗PD-1/PD-L1抗體治療過程中，治療應答的患者其外周血中Ki-67(+) PD-1(+) CD8(+) T細胞的比例逐漸升高，而疾病進展的NSCLC患者則無此現象[36]。

7 結語

腫瘤細胞與免疫系統之間的博弈貫穿整個癌癥的發生發展過程。在特定的腫瘤微環境下，癌細胞通過各種機制逃避免疫系統的攻擊。ICBs通過恢復免疫系統的活性，對腫瘤細胞進行免疫清除。目前可以通過PD-L1、MSI、突變負荷、TILs和免疫基因標簽等標記物對可能從ICBs治療中獲益的患者進行篩選。盡管如此，ICBs治療的應答率仍不盡人意，深入研究腫瘤背后的免疫逃逸機制是提高ICBs治療療效的前提。

此外，隨著對腫瘤微環境研究的不斷深入，人們發現腫瘤組織內癌細胞與微環境之間以多種方式相互影響，例如腫瘤組織PD-L1高表達，但微環境內淋巴細胞浸潤不足，或者雖然微環境內TILs浸潤豐富，但腫瘤組織低表達或不表達PD-L1[37-38]。這兩種情況下，使用ICBs治療效果都不理想。如果只采用TILs或PD-L1進行療效預測，則會過高估計這類患者的獲益情況。此外，在抑制性的腫瘤微環境中可同時存在PD-L1、CTLA-4T、細胞免疫球蛋白結構域和黏蛋白結構域-3、淋巴細胞活化基因-3分子和吲哚胺-2，3-雙加氧酶1等多重免疫抑制機制，通過聯合使用多重標記物，更準確地預測并進行聯合治療是提高療效的關鍵[10,39]。

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