胰蛋白酶抑制劑在腫瘤治療中的研究進展*

鄭文駿，毛智翔，黃琳娟 綜述，姚 軍，錢翠娟 審校

(臺州學院醫學院：1.臨床醫學系；2.醫學檢驗教研室；3.臨床醫學教研室，浙江臺州 318000)

胰蛋白酶是胰腺分泌后活化的一種酶，可以選擇性地水解蛋白質中由賴氨酸或精氨酸的羧基所構成的肽鏈，進而分解為氨基酸?？茖W家們在豆類、谷類、油料作物等植物中發現了多種胰蛋白酶抑制劑。其中，植物來源的胰蛋白酶抑制劑具有相對分子質量較小、免疫反應較弱、原料來源廣及價格低廉等優點，受到研究者的關注。目前，臨床上胰蛋白酶抑制劑已用于治療急性胰腺炎、防治腦缺血和腦水腫、抑制宮縮及預防早產等，并且取得了很好的效果[1]。已有的體外研究結果表明，存在于豆類植物中的Bowman-Birk型(BBI)和Kunitz型(KTI)胰蛋白酶抑制劑能夠通過抑制癌細胞增殖、黏附、遷移與侵襲，或促進癌細胞凋亡等方式抑制腫瘤細胞的生長，最終抑制腫瘤的發生和發展。此外，胰蛋白酶抑制劑可以與多西他塞、多西紫杉醇、環磷酰胺等多種抗癌藥物聯合使用，通過增強化療藥物的療效或者減少化療藥物的耐藥，取得更優的抗腫瘤效果[2]。但是，胰蛋白酶抑制劑仍尚未應用于臨床腫瘤的治療。因此，在腫瘤的分子靶向治療的研究中，胰蛋白酶抑制劑一直是目前研究的熱點。

1 胰蛋白酶抑制劑的基本特征

胰蛋白酶抑制劑是一種絲氨酸蛋白酶抑制劑，在人體、動物和植物中都有分布，主要功能是抑制胰蛋白酶的分泌[1-2]。多數已開發的胰蛋白酶抑制劑來源于人和動物，如從人尿中提取的人尿胰蛋白酶抑制劑、從牛肺或牛胰中提取的抑肽酶等。但是，這類胰蛋白酶抑制劑易受到病原微生物(如病毒等)的污染，且相對分子質量較大，可引起過敏反應等。另一些植物來源的胰蛋白酶抑制劑在自然界的含量豐富，活性明確，且相對分子質量較小，所以受到越來越多科研工作者的青睞，如從黃豆中提取的大豆胰蛋白酶抑制劑、從南瓜籽中提取的南瓜胰蛋白酶抑制劑等[1-2]。根據結構和性質的不同，通常將來源于豆類中的胰蛋白酶抑制劑分為兩大類，即KTI和BBI[3]。

1.1KTI KTI是在1945年首次從大豆中分離結晶出來而命名的[3]，它是一種單體蛋白質，相對分子質量在20 kDa左右，由181個氨基酸和2對二硫鍵組成，同時具有由幾個半胱氨酸殘基形成的1對或2對分子內二硫鍵所保持的高度保守的N-末端區域和結構，呈易變的非螺旋形，對熱不穩定[4]。分子內只有1個活性中心，其活性中心位于第63號的精氨酸和第64號的異亮氨酸上，主要對胰蛋白酶直接地、專一地起作用[5]。KTI屬單頭抑制劑，即一個抑制劑分子只結合一分子胰蛋白酶。

1.2BBI BBI是由Bowman在1944年作為丙酮不溶因子從大豆中分離出來的，Birk又于1961年成功純化并定義BBI；BBI也是一種單體蛋白質，相對分子質量在8 kDa左右，是由71個氨基酸組成的單肽鏈，含有7個二硫鍵和大量的半胱氨酸，具有熱穩定性[6]。2個BBI結構域由保守的二硫鍵保持，每個結構域攜帶一個活性位點，在2個不同活性位點上具有2個獨立的結合中心，即胰蛋白酶結合中心(第16號的賴氨酸，第17號的絲氨酸)和胰凝乳蛋白酶結合中心(第44號的亮氨酸，第45號的絲氨酸)，分別用于抑制胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶[7]。

2 胰蛋白酶抑制劑的抗腫瘤作用

胰蛋白酶抑制劑在腫瘤中的研究仍集中在體外研究中，尚未見到胰蛋白酶抑制劑應用于人體內腫瘤的治療的報道。目前的體外研究表明，胰蛋白酶抑制劑的抗腫瘤作用主要通過調控細胞周期、抑制腫瘤細胞增殖、促進腫瘤細胞凋亡、或抑制腫瘤細胞侵襲等實現的[6]。

2.1胰蛋白酶抑制劑的抗細胞增殖作用 現有的研究結果表明，胰蛋白酶抑制劑能夠抑制多種腫瘤細胞如人結腸癌細胞、人白血病細胞、人乳腺癌細胞、人卵巢癌細胞、舌癌細胞的生長和增殖[8-13]。

有研究者最早在番薯根中發現并提取出胰蛋白酶抑制劑[14]。研究發現，胰蛋白酶抑制劑能誘導人早幼粒白血病細胞NB4出現細胞周期阻滯，從而抑制細胞的增殖[9]。其中一種在番薯根中提取的主要儲存蛋白被命名為Sporamin，Sporamin占番薯根中總蛋白的80%，屬于KTI[15]。有研究表明，Sporamin能夠通過抑制Akt/GSK-3信號通路的轉導從而抑制體外培養的人舌癌細胞的生長和增殖，并且這種作用具有一定的濃度依賴和時間依賴性[16]。而且，Sporamin也能夠抑制體外培養的胰腺癌細胞的生長和增殖，這種作用可能與Notch4蛋白的表達下調有關[16]。

另一種類型的胰蛋白酶抑制劑BBI能夠通過上調腫瘤抑制因子-連接蛋白43(Cx43)的表達而抑制骨肉瘤細胞的增殖[17]。此外，BBI通過下調細胞周期蛋白D1、E1和ERK1/2的磷酸化及上調細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑的表達誘導人乳腺癌細胞MCF-7在G1/S期出現細胞周期停滯，且這可能與BBI對泛素-蛋白酶體機制的抑制有關[11]。另一種從豇豆種子里純化而來的黑眼豌豆胰蛋白酶/糜蛋白酶抑制劑(BTCI)則是通過抑制VEGF分泌來抑制胃癌AGS細胞及結腸癌HT-29細胞增殖[18]。

2.2胰蛋白酶抑制劑的促凋亡作用 胰蛋白酶抑制劑在細胞凋亡方面也發揮了顯著的作用，目前已發現，不同的胰蛋白酶抑制劑分別對肝癌細胞、人白血病細胞、乳腺癌細胞、人結腸癌細胞、人肺癌細胞等發揮促凋亡作用，其中誘導細胞凋亡最主要的途徑就是含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)家族的級聯反應[19-23]。

一種來源于蕎麥并經過重組的胰蛋白酶抑制劑rBTI能通過促進線粒體中細胞色素C的釋放誘導肝癌細胞H22的凋亡，同時對正常的7702細胞僅有很小的作用[19]。紫花蕓豆胰蛋白酶抑制劑通過Fas與其配體結合反應激活Caspase-8，產生一系列級聯反應導致細胞的凋亡[9]。BTCI能引起線粒體膜透化、溶酶體膜透化和DNA斷裂導致乳腺癌細胞的凋亡[11]。

胰蛋白酶抑制劑還能通過影響轉錄因子來促進癌細胞的凋亡。在結腸癌細胞中存在一種過表達的高度保守的核蛋白高遷移率族蛋白1(HMGB1)，經研究發現這種蛋白與結腸癌的進展關系密切[24]。尿胰蛋白酶抑制劑烏司他丁能抑制HMGB1的表達，同時增加NF-κB活性導致其靶基因產物c-IAP2的過表達來達到促進細胞凋亡的作用[22]，同時還能抑制Caspase-9和Caspase-3的活性[25]。另外一種新型經苦瓜提取的生物活性肽BG-4表現出顯著的胰蛋白酶抑制作用，研究發現，BG-4能通過上調Bax蛋白的表達并下調X連鎖凋亡抑制蛋白的表達，從而促進結腸癌細胞的凋亡[26]。

2.3胰蛋白酶抑制劑的抗侵襲作用 腫瘤的侵襲能力主要體現在細胞外基質的降解、血管淋巴管的生成、上皮細胞-間充質轉化等方面，而胰蛋白酶抑制劑能通過影響這些過程來達到抗侵襲的作用。

Bikunin也是一種KTI。一方面，Bikunin能通過抑制胞外鈣離子內流，來抑制轉化生長因子(TGF)-β1介導的ERK信號轉導及Src酪氨酸激酶的活化，從而導致HRA細胞中PA系統的抑制[27]。另一方面，妊娠相關血漿蛋白-A基因與MT-SP1基因可能分別作為Bikunin處理后的早期反應基因與晚期反應基因，而二者都與癌細胞的侵襲相關[28]。此外，BBI能通過抑制基質金屬蛋白酶(MMP)-2和MMP-9的分泌和活性，來阻礙癌細胞的侵襲和轉移，同時可以明顯地降低VEGF的產生和分泌，從而抑制腫瘤的血管生成[18]。

胰蛋白酶抑制劑EcTI則是通過抑制胃癌細胞整合素-β1的表達，造成了Src-FAK通路受阻，進而阻止Cortactin上主要的Src磷酸化位點發生酪氨酸磷酸化，使細胞偽足無法形成，抑制細胞的黏和侵襲作用[29]。此外，EcTI可通過抑制MMP-9、MMP-12、金屬蛋白酶組織抑制因子-1(TIMP-1)等抑制腫瘤細胞侵襲作用[30]。

3 胰蛋白酶抑制劑的應用

烏司他丁現與多種抗癌藥合用，來增強其藥效。烏司他丁與多西他塞通過抑制血管生成和上皮間質轉化(EMT)，從而抑制乳腺癌的侵襲和轉移，二者具有協同作用[31]。此外，有研究表明,烏司他丁和環磷酰胺處理小鼠異種移植乳腺癌細胞MCF-7，兩者都能有效抑制癌細胞中CXCR4和MMP-9的表達，且二者具有協同作用[16]。同時烏司他丁也能增強多西紫杉醇的抗癌作用[5]，不過烏司他丁增強多西紫杉醇的抗癌作用的機制還不清楚。

除了與其他抗癌藥物合用之外，還可以通過胰蛋白酶抑制劑與功能型多肽重組來進行抗腫瘤治療。葡萄糖調節蛋白78(GRP78)是一種在癌細胞的細胞膜上表達，且在正常細胞不表達的蛋白質[32]。因此，通過GRP78來行抗腫瘤治療是可行的。而綠豆胰蛋白酶抑制劑(mTI)是一種經綠豆提取的胰蛋白酶抑制劑，研究表明，通過GRP78的結合肽WIFPWIQL與mTI的融合形成重組蛋白GBP-TI，GBP-TI能通過GBP與GRP78的結合顯著提高其入胞的能力，再通過mTI的抗癌作用對結腸癌細胞產生特異且強大的生長抑制和凋亡誘導作用，該重組過程不影響二者酶活性，且能顯著增強其抗癌作用[33]。

4 小 結

在不同的腫瘤中胰蛋白酶抑制劑具有不同的表達趨勢，目前胰蛋白酶抑制劑在腫瘤細胞中的效應還未完全明確，其在腫瘤中發揮的作用機制還需要更深入的研究。同時，對胰蛋白酶抑制劑的研究還只停留在細胞、動物試驗的層面，胰蛋白酶抑制劑在早期癌癥臨床治療、聯合用藥及預后等方面的作用也需要更深入的研究。